产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响

车 鑫，毛 健，3，*，刘双平，3，周志磊，3，薛景波（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000）



产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响

车 鑫1，2，毛 健1，2，3，*，刘双平1，2，3，周志磊1，2，3，薛景波1，2
（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000）

摘 要：经洛伐他汀（Monacolin K）抗性平板筛选和固态发酵实验验证，从红曲分离源中得到一株产洛伐他汀能力最强的菌株，并命名为M2-1，发酵12 d后其洛伐他汀产量可达1.472 mg/g（以干基计）。结合形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区序列分析，将其鉴定为红色红曲菌（Monascus ruber）。考察15 种药食同源中药及其添加形式（药粉、药汁）对菌株M2-1固态发酵产洛伐他汀、色价等指标的影响，结果显示：陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制备药红曲效果最佳（P＜0.05），其中陈皮粉红曲和山楂汁红曲的洛伐他汀和色价最高，分别为2.118 mg/g和320.12 U/g，分别较普通红曲提高43.89%和71.79%。本研究发现多种中药能够促进红曲菌产洛伐他汀和红曲色素，为进一步提升传统红曲的药食两用功能提供了新的思路。

关键词：红色红曲菌；中药；固态发酵；洛伐他汀；色价

引文格式：

车鑫， 毛健， 刘双平， 等.产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 114-119.

红曲菌属真菌（Monascus spp.）接种于大米，经固态发酵得到的制品即为红曲［1］。红曲是我国传统的食药两用发酵产品，被广泛应用于食品着色、酒类糖化发酵、肉类保鲜、降脂保健医疗等各个领域［2］。红曲菌在发酵过程中能代谢产生红素色素、水解酶类、洛伐他汀（Monacolin K）、麦角固醇、γ-氨基丁酸等多种有益物质［2-4］。其中，红曲色素是一类天然、安全的食品着色剂，普遍存在于红曲产品中，其有效成分通常以色价表示［5］；洛伐他汀为一种关键的降脂功效成分，临床研究表明，洛伐他汀红曲具有降脂效果显著、无不良反应等优点［6-7］。然而，并非所有红曲菌属真菌都能代谢产生洛伐他汀，从目前报道来看［3］，主要以红色红曲菌（M.ruber）、紫色红曲菌（M.purpureus）和丛毛红曲菌（M.pilosus）3 个种为主，其野生菌株的洛伐他汀固态发酵产量一般在0.53～2.80 mg/g。

固态发酵因具有投资少、能耗低、产量高、环境污染小等优点，已得到世界各国的重视［8］。目前关于提高固态发酵产物产量的研究主要集中在菌种选育、培养条件优化和生物反应器选择等方面［9-11］。近年来有学者研究发现一些外源添加物如中药，能进一步较大幅度地提高真菌发酵代谢产物的产量：罗芳等［12］考察了21 种中药对米曲制备的影响，发现红景天、黄芪、西洋参对糖化酶活力和液化酶活力的提高效果最为显著，提高率为36.76%～59.43%；崔培梧等［13］研究发现添加质量浓度为1 g/100 mL的黄芪、茶叶、麦芽、三七、葛根或穿心莲，均能使茯苓菌发酵体系表现出极强的胞外多糖合成能力，认为植物药能起到发酵调控作用；刘高强等［14］研究了5 种药用昆虫对灵芝多糖生物合成的影响，结果表明蜣螂在添加量为5 g/L时，虽不能促进灵芝细胞的生长，但却能显著促进灵芝多糖的形成（P＜0.05），提示蜣螂虫粉中含有促进灵芝多糖形成的功能因子。可见，中药的引入可为固态发酵调控提供一种新的策略和手段。另外，中药本身具有一定的营养、风味和功能性成分，应用于发酵可以增加产品的附加值。例如我国一些酿造法制备的药酒（如董酒）在粮醅拌曲发酵时加入药粉或药汁，不仅起到调控酿酒微生物发酵的作用，亦能提升酒体的香味和保健功效。综上可见，中药与固态发酵实践相结合具有重要意义，而有关中药影响产洛伐他汀红曲菌的固态发酵目前未见报道。

曾有学者探讨了中药对酿酒红曲固态发酵的影响［15］，结果表明，西洋参和红景天能够显著提高红曲酶活。借鉴该研究思路，本研究从我国传统制曲用药和相关文献常见药材中遴选出15 味药食同源中药，考察其对产洛伐他汀红曲菌固态发酵洛伐他汀、色价等指标的影响，以期为深度开发药食两用红曲提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基和药材

1.1.1 红曲样品

从福建宁德、三明市，浙江温州、丽水市和广东梅州市采集11 份红曲样品。

1.1.2 培养基

分离和保藏培养基（g/L）：麦芽汁粉100、琼脂20，自然pH值；察式酵母提取粉琼脂（Czapek's yeast extract agar，CYA）培养基［16］；洛伐他汀抗性培养基（g/L）：可溶性淀粉5、蛋白胨1、琼脂20、洛伐他汀0～800，自然pH值。以上培养基于0.1 MPa灭菌20 min。

固态发酵培养基：取35 g籼米用pH 5.0乳酸水浸泡2 h，沥干后装入250 mL三角瓶，8 层纱布封口后于0.08 MPa灭菌20 min，趁热摇散米粒，冷却至室温备用。

1.1.3 中药

白芷、丁香、茯苓、黑胡椒、肉豆蔻、杏仁、桑叶、甘草、赤小豆、牡蛎、枸杞、桑葚、麦芽、陈皮、山楂，均属药食同源药材，购自无锡山禾集团中药饮片有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ系列超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；UV-2100紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；Waters e2695高效液相色谱系统（配有2489紫外检测器及Empower 2色谱工作站） 美国沃特世公司；CX31RTSF显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 产洛伐他汀菌株的筛选

初筛：称取红曲样品5 g至盛有95 mL带玻璃珠的无菌生理盐水的三角瓶中，振荡20 min后取悬浮液0.5 mL进行梯度稀释，取0.1 mL涂布于分离培养基，于28 ℃培养5～6 d，灭菌牙签挑取单菌落转至新的分离平板，相同条件下多次纯化，结合显微形态挑选具有红曲菌基本特征的菌株［16］，于4 ℃斜面保藏。

复筛：使抗性培养基的洛伐他汀质量浓度分别为0、50、100、200、400、800 mg/L，三点接种斜面保藏的菌株，于28 ℃倒置培养3 d，观察菌落生长情况，选择在高质量浓度洛伐他汀平板上生长良好的菌株。

固态发酵验证：考察复筛菌株，以接种量105个孢子/g（以干基计）接种于固态发酵培养基；补加pH 5.0乳酸水使干基水分含量为0.8；摇瓶使培养基堆至瓶内一角，于28 ℃静置培养2 d；用无菌药匙将培养基捣散、摊平，以吸收瓶内水分；此后每24 h摇瓶1 次，直到第12天发酵结束。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定洛伐他汀产量，选择产量高的菌株用于后续研究。实验重复3 次取平均值。

1.3.2 菌株鉴定

个体形态观察：采用载片培养法在25 ℃条件下培养7 d，用乳酸石碳酸棉蓝染色液制成水浸片，高倍镜下观察受试菌的个体形态和结构。

菌落形态观察：采用点种法将受试菌接种于CYA培养基，在25 ℃条件下培养7 d，观察菌落特征，包括大小、颜色、表面质地、边缘。

分子生物学鉴定：以受试菌总DNA［17］为模板，采用核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer of ribosomal DNA，rDNA-ITS）通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，产物送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。结果通过BLAST程序与GenBank核酸数据库比对，选取同源性高的模式菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA5.0软件进行多序列比对分析，以Neighbor-Joining法构建系统进化树［18］。

1.3.3 药红曲的制备

药粉准备：中药于45 ℃烘干24 h，粉碎后取20～50 目细粉，0.8 MPa条件下灭菌20 min，冷却后于4 ℃冰箱保存。

药汁准备：取上述药粉4 g于50 mL离心管，加入20 mL去离子水，室温浸泡4 h，0.8 MPa条件下灭菌20 min，冷却后5 000 r/min离心15 min，取上清于4 ℃冰箱保存。

固态发酵：取0.2 g药粉或1 mL药汁加入固态发酵培养基，按照1.3.1节固态发酵方法培养得到药红曲，测定发酵失质量、洛伐他汀产量和色价。实验重复3 次取平均值，以不加药的普通红曲为空白对照。

1.3.4 指标测定

发酵失质量：称量（精确至0.001 g）发酵起始培养基湿质量与发酵结束培养基湿质量，两者之差即得发酵失质量。

洛伐他汀产量：采用HPLC法，准确称取红曲粉0.5 g置于50 mL比色管，加入体积分数70%的乙醇30 mL，50 ℃超声提取1 h（250 W，40 kHz），摇匀，8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜。色谱条件：色谱柱：Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%的磷酸水溶液（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：238 nm；进样量：5 μL；柱温：（30.0±0.5）℃。外标定量，结果以酸式洛伐他汀计。

色价：采用分光光度计法，参见国标GB 4926—2008《食品添加剂 红曲米（粉）》。

1.4 数据分析

采用逼近理想点排序法（technique for order preference by similarity to an ideal solution，TOPSIS）对1.3.3节的数据进行综合评价以确定最优药红曲方案。基于同向化、归一化后的原始数据矩阵，找出理论最优、最劣方案，然后分别计算各评价方案与最优、最劣方案间的欧式距离，获得各评价方案与最优方案的相对接近程度，以此作为评价优劣的依据［19］。显著性分析采用t检验。

2 结果与分析

2.1.1 菌株筛选结果

经梯度稀释和分离培养基纯化，从11 份红曲样品中获得纯培养菌株共计32 株，经显微镜检初筛，得到9 株具有红曲菌典型特征的菌株，命名为M1、M6、M8、M9、M11、M17、M2-1、M2-2、M3-1。接种于洛伐他汀抗性培养基，28 ℃培养3 d后，菌株生长情况有明显差异（图1）。以菌株M6、M8和M2-1为例，空白平板（左起第一列）所有菌株均能正常生长，抗性平板仅菌株M2-1能够生长但长势较空白平板稍差，但未发现受高质量浓度洛伐他汀抑制现象。结果表明，洛伐他汀会对真菌生长产生抑制作用，与此前的报道一致［20-21］；菌株M2-1对高质量浓度洛伐他汀不敏感，是高产洛伐他汀的潜在菌株，故选为目标菌株进行固态发酵验证。

2.1.2 菌株产洛伐他汀的固态发酵验证

以菌株M2-1固态发酵红曲，采用HPLC精确定量洛伐他汀，以其他菌株为对照。由图2可知，菌株M2-1的洛伐他汀产量为1.472 mg/g（以干基计，下同），显著高于其他菌株，故确定菌株M2-1为供试菌进行后续实验。

2.2 菌株M2-1的鉴定

2.2.1 菌落和个体形态学特征

由图3a、b可知，在高倍显微镜镜下观察，菌株M2-1的闭囊壳呈球形，直径45 μm左右，单生在菌丝上，由纠结的菌丝构成；菌丝具有横隔，3～6 μm宽；分生孢子成串着生在菌丝顶端，倒梨形或球形。由图3c可知，25 ℃条件下，在CYA平板上培养7 d后，菌株M2-1菌落直径20～23 mm，放射状，边缘呈流苏状，褐色，平坦，表面质地丛卷毛状。参照《真菌鉴定手册》［22］和《红曲菌的形态与分类学》［16］，菌株M2-1可初步鉴定为红曲菌属（Monascus spp.）。

2.2.2 分子生物学鉴定

2）自动化控制系统。地面控制系统均为撬装OCS控制器独立运行，地面压力信号与现场井口BB井控系统进行联锁。当地面撬装设备压力高于设定值时自动关井，具有紧急关井联锁功能，从而确保运行安全可靠。地面各撬装采用就地控制与中控室控制相融合，撬块上的各重要工艺参数的显示、控制、报警以及各相关逻辑联锁保护控制均由中控室DCS+PC系统进行远程监控。

菌株M2-1的rDNA-ITS PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，由图4可知，产物条带单一、明亮，说明特异性扩增良好，测序后得到长度为582 bp的序列，在NCBI上比对发现与红色红曲菌Monascus ruber FRR2447的同源性达99%以上，构建系统进化树（图5），菌株M2-1与Monascus ruber的亲缘关系最近（相似度100%）。结合形态学特征，将菌株M2-1鉴定为Monascus ruber。该种是常见的三大红曲固态发酵菌种之一［23］，具有较强的产洛伐他汀和红曲色素能力。

2.3 中药对红色红曲菌M2-1固态发酵的影响

2.3.1 对发酵失质量的影响

长时间的红曲固态发酵过程中，底物经红曲菌分解代谢后产生水和二氧化碳，水分蒸发和二氧化碳逸出造成质量损失，因此发酵失质量能够反映红曲菌的代谢活跃程度［24］。由图6可知，与空白对照组相比，添加白芷粉/汁、丁香粉、茯苓粉、黑胡椒粉、肉豆蔻粉、桑叶粉、甘草粉、赤小豆粉、牡蛎粉、枸杞粉、桑葚汁、山楂汁红曲的发酵失质量增加；添加茯苓汁、肉豆蔻汁、杏仁粉/汁、桑叶汁、甘草汁、牡蛎汁、桑葚粉、陈皮汁时发酵失质量降低；添加丁香汁、黑胡椒汁、赤小豆汁、枸杞汁、麦芽粉/汁、陈皮粉、山楂粉对发酵失质量影响不明显。结果表明，15 种中药材对红曲菌的生长代谢有三方面作用：促进、无效和抑制，原因可能是中药的多种成分综合作用于菌体生长的结果［25］，其作用机制尚有待进一步研究。

2.3.2 对洛伐他汀产量的影响

由图7可知，普通红曲洛伐他汀产量为1.472 mg/g，添加白芷粉/汁、丁香汁、茯苓粉、黑胡椒汁、杏仁粉、桑叶粉、枸杞粉/汁、桑葚粉、麦芽粉、陈皮粉/汁、山楂粉/汁发酵对洛伐他汀的生成有促进作用，其中以陈皮粉效果最显著（P＜0.01），达到2.118 mg/g，较普通红曲提高43.89%；而添加茯苓粉/汁、黑胡椒粉、肉豆蔻粉/汁、桑叶汁、甘草粉、赤小豆粉、牡蛎粉、桑葚汁、麦芽汁发酵对洛伐他汀的生成有抑制作用；白芷汁、丁香粉、杏仁汁、甘草汁、赤小豆汁、牡蛎汁的添加对洛伐他汀的生成影响不明显。上述结果表明，中药种类与添加形式（药粉、药汁）均会对红曲菌生长代谢产生影响，与李丽等［15］的研究结论一致。由于受试药材本身不含他汀类物质，因此可判定红曲洛伐他汀产量的提高来源于中药的间接作用，其机理可能是中药弱极性或非极性成分（如中、长链脂肪酸）使红曲菌细胞膜通透性增加，从而有利于营养物质的摄取和洛伐他汀的分泌［26］，或是中药的有效物质能影响生物合成途径，有利于洛伐他汀的生成［27］。

2.3.3 对色价的影响

色价能在一定程度上反映红曲色素含量的高低和着色能力的强弱。由图8可知，添加白芷粉、丁香汁、黑胡椒汁、桑叶粉、陈皮粉、山楂粉/汁有利于提高红曲色价，其中山楂汁的效果最为显著（P＜0.01），达到320.12 U/g，较普通红曲提高71.79%；丁香粉对红曲色价无明显作用；除以上药材外，其他药材的添加均会从不同程度上降低红曲色价，说明在本实验药材的添加量下，抑制红曲色素合成的因子起主导作用，但根据赵燕等［28］的报道，不排除有促进因子的存在，需通过改变添加量进行验证。中药对色价的影响相对洛伐他汀指标更加复杂，因为药材成分除了可以间接作用于红曲菌产色素外，一些药材（如黑胡椒、陈皮、山楂等）自身的天然色素也可直接贡献于红曲色价；虽然枸杞红色素在本实验的低温和酸性发酵环境下较稳定［29］，能够对色价产生直接正效应，但可能不足以抵消枸杞中抑制因子产生的负效应，因此最终表现为降低红曲色价；此外，红曲色素的产生是一个耗氧过程［30］，而药粉能够疏松曲料，有利于氧气传递，这可能是桑叶粉红曲色价较高的部分原因。

2.3.4 确定最佳制曲药材

注：Di+.评价方案与最优方案的欧氏距离；Di－.评价方案与最劣方案的欧氏距离；Ci.评价方案与最优方案的接近程度，Ci∈［0，1］，其值越大，评价结果越优。

TOPSIS法是一种优秀的多目标决策和多属性评价方法，具有计算简便、应用灵活的优点，在经济、社会、科技、环境等领域得到了非常广泛的应用［19，31］。根据图5～7中的数据，利用该法对药红曲综合评价。考虑到发酵失质量指标的增加会造成产品得率下降，故将其确定为低优指标，而洛伐他汀和色价显然为高优指标。用药方案的优劣按照Ci值排序，结果见表1。排序前7位药红曲的Ci值显著高于普通红曲（Ci＞0.555，P＜0.05），即陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉用于制备药红曲效果最佳。从药材成分来看，这些药材的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等丰富的营养成分可被红曲菌的酶系分解，用于菌体生长和产物合成；从中药理论来看，这些药材大多属温性，味苦、辛，与红曲药性相近而味相反，根据传统制曲用药规律［32］，促进真菌活动和抑制细菌繁殖的双重作用可能是这些药材制曲效果较好的原因。

3 结 论

洛伐他汀作为红曲菌的次级代谢产物，会在一定程度上抑制其自身生长。本研究利用该原理从红曲分离源中筛选得到一株对洛伐他汀抗性最强的菌株M2-1，经固态发酵验证，发现其洛伐他汀产量也最高，该菌株能在较短的发酵时间内（12 d）发酵积累较高的洛伐他汀（1.472 mg/g），通过形态学和分子生物学鉴定为红色红曲菌（Monascus ruber）。

药材种类和添加形式对红色红曲菌M2-1固态发酵影响显著。通过TOPSIS综合评价结果可知，陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制备药红曲的效果显著优于普通红曲（P＜0.05），其中，陈皮粉红曲的洛伐他汀产量和山楂汁红曲的色价最高，分别较普通红曲提高43.89%和71.79%。本研究为进一步提高红曲的降脂保健和着色效果提供了新的思路，对深度开发药食两用红曲有良好的应用前景。此外，中药添加量和复配作用会如何影响红曲固态发酵，还需作进一步研究。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613020 10.7506/spkx1002-6630-201613020. http://www.spkx.net.cnCHE Xin， MAO Jian， LIU Shuangping， et al.Screening of Monacolin K-producing Monascus and effects of Chinese medicinal herbal materials on Monacolin K production in solid-state fermentation［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 114-119.（in Chinese with English abstract） 10.7506/spkx1002-6630-201613020. http://www.spkx.net.cn

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）13-0114-06

收稿日期：2015-09-10

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571823）

作者简介：车鑫（1990—），男，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：403995925@qq.com

*通信作者：毛健（1970—），男，教授，博士，主要从事食品生物技术研究。E-mail：biomao@263.net

Screening of Monacolin K-Producing Monascus and Effects of Chinese Medicinal Herbal Materials on Monacolin K Production in Solid-State Fermentation

CHE Xin1，2， MAO Jian1，2，3，*， LIU Shuangping1，2，3， ZHOU Zhilei1，2，3， XUE Jingbo1，2
（1.School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine， Shaoxing 312000， China）

Abstract:One strain with the most powerful capability of producing Monacolin K named M2-1 was screened from red mold rice （RMR） using Monacolin K-containing plates and validated by solid-state fermentation.The yield of Monacolin K reached 1.472 mg/g （dry basis） after 12 d fermentation.The strain was identified as Monascus ruber by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.The effects of powders and water extracts of 15 edible and medicinal herbs on Monacolin K production and color value of M2-1 in solid-state fermentation were studied.Results indicated that Pericarpium Citri Reticulatae， Fructus Crataegi， Folium Mori and Radix Angelicae Dahuricae powder as well as Fructus Crataegi， Flos Caryophylli and Fructus Piperis extracts significantly improved the quality of RMR （P < 0.05）.By adding Pericarpium Citri Reticulatae powder and Fructus Crataegi extract to the fermentation medium， the maximum Monacolin K production of 2.118 mg/g and the highest color value of RMR of 320.12 U/g were obtained which were increased by 43.89% and 71.79% compared those obtained with the ordinary strain， respectively.This study discovered a variety of Chinese medicinal herbs that could promote the production of Monacolin K and Monascus pigment by Monascus ruber， which will provide a novel strategy for improving the efficacy of traditional RMR as an edible and medicinal resource.

Key words:Monascus ruber； Chinese medicinal herb； solid-state fermentation； Monacolin K； color value