鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

任志浩，房立春，栾怀彪，李　阳，王一新，崔治中，常　爽，赵　鹏

(山东农业大学动物医学院，泰安 271018)



鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

任志浩#，房立春#，栾怀彪，李阳，王一新，崔治中，常爽*，赵鹏*

(山东农业大学动物医学院，泰安 271018)

摘要：为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中鸡传染性贫血病毒(CIAV)的污染，根据CIAV基因组保守序列设计合成了引物及TaqMan探针，通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，建立的检测方法灵敏度可达10拷贝·μL-1，比常规PCR灵敏度高100倍。该方法与禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒以及马立克病病毒等病毒基因均无交叉反应，具有很好的特异性；批内重复和批间重复显示变异系数均小于2%，呈现良好的可重复性。在模拟试验中，该方法能够检测到1 000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染，应用该方法从送检的39种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性。上述结果表明，本研究建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异性强，重复性好，可用于检测疫苗中CIAV低剂量的污染。

关键词：鸡传染性贫血病毒；实时荧光定量PCR；弱毒疫苗；污染

鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起雏鸡骨髓造血组织和胸腺等淋巴组织的萎缩，并导致感染鸡发生贫血和免疫抑制。自1979年日本学者首次报道CIAV以来[1]，CIAV感染已在我国及其他国家普遍存在[2-6]。由于CIAV感染非常普遍并可以通过种蛋垂直传播，在养禽场(特别是种禽场)中受到高度重视。

在过去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被证实存在一些外源性病毒的污染，这些病毒主要是能够通过鸡胚垂直传播的病毒，其中CIAV在禽弱毒疫苗中的污染已在国内外得到证实[1，7]。由于疫苗接种的特殊性，一旦使用污染有外源病毒的弱毒疫苗将使鸡场产生近似于人工攻毒的普遍性效果，因此加强对禽弱毒疫苗中CIAV污染的监测对于种禽场防控CIAV极其重要。目前，我国兽药典中针对鸡马立克病活疫苗等生物制品中CIAV的检测主要是依据接种SPF鸡检测抗体结果来判断其中是否存在CIAV污染，但这一方法周期较长并需要严格的实验动物设施。目前，人们把目光集中于分子生物学检测方法，如PCR等被证实可以从商品化疫苗中检测出CIAV污染[7]。通常情况下，在禽弱毒疫苗中CIAV等外源病毒污染的剂量比较低，这就需要用非常灵敏而特异的方法来进行检测。本研究在对大量CIAV基因组分析基础上设计和合成了相关引物与探针，建立了用于检测CIAV的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，不仅在模拟试验中被证实可有效检测疫苗中低剂量的CIAV污染，还成功从商品化疫苗中检测到CIAV污染。

1材料与方法

1.1毒株和细胞

CIAV-SDLY08株为2008年本实验室从山东某商品代肉鸡中分离鉴定的野毒株[8]，在鸡胚上增殖后测定其鸡胚半数感染量(EID50)。鸡马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)以及不同亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)均由本实验室分离鉴定和保存。SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)后用于MDV、REV以及ALV-A/B/J等病毒的增殖。

1.2引物和探针的设计

根据GenBank已经发表的以及本实验室近年来测定但尚未发表的CIAV全基因组序列，使用Lasergene 7.0 软件寻找CIAV最保守区域，应用Primer 5.0 软件设计了引物和探针(表1)，引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

表1　本研究中所使用引物及探针

1.3荧光定量PCR的建立和条件优化

取保存的CIAV病毒液参照说明书以病毒核酸提取试剂盒提取病毒DNA，以“1.2”中合成引物扩增相应DNA片段，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并以OMEGA公司凝胶回收试剂盒进行回收纯化。纯化产物与pMD 18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落使用质粒提取试剂盒提取质粒后进行酶切鉴定，并送商业公司测序验证。验证后阳性质粒标准品使用核酸定量系统对其进行定量并计算其拷贝数。以不同稀释度的阳性质粒标准品为模板，将荧光定量PCR上下游引物和探针加入到反应体系中，于ABI 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。分别选用10、25、50 nmol·mL-1的引物浓度和5、12.5、25 nmol·mL-1的探针浓度，使用矩阵法对上下游引物、探针浓度进行筛选和优化，以得到最佳反应体系和反应条件。

1.4荧光定量PCR的敏感性、特异性和重复性检测

将1×108拷贝·μL-1的重组质粒进行10倍梯度稀释至浓度范围1×108～1×101拷贝·μL-1，进行荧光定量PCR反应，进行敏感性检测。同时以等量的质粒DNA为模板，进行常规PCR反应，取扩增产物5 μL，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，计算两种方法所能检测出的最低模板浓度，比较两者敏感性的差异。分别以ALV-A/B/J、MDV、CIAV、REV的DNA或cDNA为模板，使用所建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，同时设置灭菌超纯水为阴性对照。对不同梯度浓度稀释的质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，每个梯度进行3次反应，通过组内的CT值变异系数(标准偏差/重复值平均数)评估所建立方法的重复性。另外，取3份CIAV阳性组织样品，以其为模板进行荧光定量PCR检测，分析该方法的批内和批间重复性。批内重复：将上述3份DNA分别设立3个重复，在同一条件下同时检测，计算批内变异系数；批间重复：将上述3份DNA在同一条件下进行3次独立的荧光定量PCR检测，计算批间变异系数。

1.5荧光定量PCR在检测CIAV污染中的应用

将定量好的CIAV分别以无菌的PBS稀释至2×103、2×102、2×10、2×1、2×0.1 EID50·mL-1，然后分别以包含不同病毒含量的上述PBS稀释5瓶同一批次的鸡痘活疫苗(1 000羽份)，即分别人为污染了103、102、10、1、0.1 EID50·1 000-1羽份CIAV的5瓶鸡痘活疫苗，另用2 mL无菌PBS稀释1瓶同一批次的鸡痘活疫苗(1 000羽份)作为空白对照。上述不同疫苗以病毒核酸提取试剂盒提取病毒DNA后按照本研究建立的方法进行荧光定量PCR检测，同时以本研究引物进行常规PCR检测。按照上述操作在MDV活疫苗中人工加入不同剂量的CIAV模拟不同剂量的污染。

另外，对四家种禽企业送检的39种(批)弱毒疫苗提取核酸后按照上述操作分别使用本研究建立的荧光定量PCR方法和常规PCR进行检测，对于两种方法结果不一致的参照《中国兽药典》使用SPF鸡检查法进行复核检测。

2结果

2.1实时荧光定量PCR的建立和条件优化

对实时荧光定量PCR的反应条件进行了优化，确定引物和探针的最佳浓度分别为10和25 μmol·mL-1。反应体系为20 μL，其中含10 μL 2×Premix ExTaq(2×)(Probe qPCR)，ROX plus 缓冲液，上、下游引物各0.5 μL，探针0.4 μL，模板2 μL，用灭菌超纯水补足体积。反应条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃34 s(收集荧光信号)，扩增40个循环。使用优化后的条件进行实时荧光定量PCR反应，以10倍梯度稀释(1×108～1×101拷贝·μL-1)的阳性质粒标准品为模板进行扩增，获得了检测CIAV的动力学曲线(图略)和标准曲线(图略)。结果显示在模板为108～101拷贝·μL-1浓度时具有良好的线性关系，R2值达到0.996。拷贝数对数值(x)与CT值的关系为y=-3.215x+41.4。说明标准品的起始模板浓度与CT值呈现良好的线性关系。

2.2实时荧光定量PCR的敏感性、特异性和重复性试验

通过对重组质粒各稀释度样品进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，本方法对重组质粒进行扩增最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝，而常规PCR方法在103个病毒核酸分子拷贝时能勉强观察到目的条带(图略)，表明本研究所建立的实时荧光定量PCR方法比普通PCR灵敏度高出约100倍。用所建立的实时荧光定量PCR方法对ALV-A/B/J、MDV、REV的DNA或cDNA进行检测均无扩增信号，而质粒标准品有良好的扩增，表明该方法具有良好的特异性(图略)。取3份CIAV阳性肝组织样品，提取组织DNA，进行3次实时荧光定量PCR检测。结果显示，批内重复和批间重复的变异系数均小于2%(表2)，表明该方法具有良好的可重复性和稳定性。

2.3实时荧光定量PCR检测弱毒疫苗中CIAV污染

利用建立的荧光定量PCR检测方法对人工混入不同弱毒疫苗中五个不同污染剂量的CIAV污染检测结果显示可检测到1 EID50·1 000-1羽份的低剂量污染，而空白疫苗检测为阴性，显示所建立的CIAV荧光定量方法不仅具备较高的灵敏度，还具有非常好的特异性。而使用同一引物进行常规PCR检测，仅仅可以检测到103EID50·1 000-1羽份(表3)。

使用建立的荧光定量PCR方法从39种(批)弱毒疫苗中检测到2份CIAV阳性，尽管疫苗送检时标签已撕掉，厂家未知，但巧合的是这两份样品均为FPV活疫苗；将这2份FPV活疫苗接种SPF鸡后分别在35和42 d时均检测到CIAV特异性抗体，判定为CIAV污染阳性，但以常规PCR检测这2份样品判定为阴性。

表2　重复性试验结果

表3　荧光定量PCR检测人工污染不同剂量CIAV结果

3讨论

在过去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被证实存在一些外源性病毒的污染，这种现象主要是使用了污染有其他病毒的SPF鸡胚或毒种生产疫苗造成的，这些病毒主要是能够通过鸡胚垂直传播的病毒，如ALV、REV、CIAV等。目前针对外源病毒污染的报道最多的是ALV[9-13]和REV[14-16]，此外就是CIAV污染[1，7]。

目前对疫苗中外源病毒污染的检测主要包括细胞培养检查法以及经典的SPF鸡检查法，但是绝大多数疫苗(如MDV活疫苗)的检测非常复杂和困难，这是因为MDV等接种CEF细胞后能够产生细胞病变，使污染的病毒复制受到干扰。尽管经典的SPF鸡检查法相对可靠，但其周期较长成本也比较高，更重要的是对于一般种禽场存在困难，因为这需要特定的设备并要求长期饲养SPF鸡备用。因此越来越多的检测机构试图通过分子生物学检测方法来检测疫苗中ALV、REV和CIAV的污染。

但是，对于常规的分子生物学检测方法来讲，在检测ALV和REV时经常会检测到假阳性的结果，这是因为对REV来讲，存在着REV与其他病毒的基因重组。早已证实，REV的基因成分能够整合进其他病毒的基因组中，报道最多的是MDV等基因组较大的病毒基因组中[17-19]，例如2004年在我国已经分离到整合进REV的LTR基因片段的天然MDV重组野毒株[20-21]。除了MDV外，最容易整合进REV基因成分的是FPV[22-24]，在我国FPV疫苗以及野毒株中整合进REV基因片段的研究也已有报道[25]。而对ALV来讲，内源性ALV的干扰无疑是非常严重的，一般的分子生物学检测会受到内源性ALV的干扰而出现假阳性。

相对于上述ALV和REV基因的复杂性，CIAV基因组较小并且其基因组非常保守。CIAV属圆环病毒科圆环病毒属，有3个开放阅读框(ORF)，分别编码衣壳蛋白(VP1) 、分子伴侣(VP2)和凋亡素(VP3)，在3个ORF中只有VP1的变异相对较大，但不同毒株之间同源性也非常高[3-6]，因此可以用常规的分子生物学方法来检测疫苗中CIAV的污染，例如邵红霞等就建立了针对CIAV的PCR检测方法并在一些商品化疫苗中检测出CIAV的污染[7]。

通常，在禽弱毒疫苗中CIAV污染的剂量是非常小的，这可能导致一般的PCR方法无法有效检测出一些低剂量的CIAV污染。本研究通过对大量CIAV毒株(约90株以上)的分析，选取CIAV最保守的基因区域建立了针对CIAV的TaqMan探针实时荧光定量检测方法，并证实其灵敏度、特异性和可重复性均非常良好。为了验证所建立的方法在检测疫苗中CIAV污染的最低限度，作者在MDV等弱毒疫苗中分别人工加入了不同剂量的CIAV，然后使用所建立的方法进行检测，通过模拟试验观察此方法在检测弱毒疫苗中CIAV污染的可行性。结果显示所建立的荧光定量PCR方法展示了灵敏度优势，该方法可以检测出MDV等弱毒疫苗中1EID50/1 000羽份的CIAV污染，这种污染剂量已经很低了。实际上，即使再低剂量的污染检测不到我们也无须担心，因为那种剂量的污染已经接近于零的水平，感染鸡后不会导致任何不良结果。所建立荧光定量PCR检测方法灵敏度优势在检测商品化疫苗中得到了更好的体现，利用常规PCR方法对市场上购买的39种(批)弱毒疫苗检测均未检测到CIAV阳性，但本研究建立的荧光定量PCR方法则检测到2种FPV弱毒疫苗中存在CIAV污染，并进一步通过接种SPF鸡的经典金标准得到了证实，这一结果提示对于商品化弱毒疫苗中CIAV污染的监测仍需高度重视。本研究建立的方法将有助于企业能够准确而快速地检测禽弱毒疫苗中的CIAV污染，为防控CIAV的传播提供可借鉴的手段。

4结论

根据CIAV基因组保守序列设计合成引物及TaqMan探针，建立了快速检测CIAV的实时荧光定量PCR检测方法。建立方法的检测灵敏度可达10拷贝·μL-1，该方法能够检测到1 000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染。应用该方法从送检的39种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性。建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异性强，重复性好，可用于检测疫苗中CIAV低剂量的污染。

参考文献(References)：

[1]YUASA N，TANIGUCHI T，YOSHIDA I.Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chicks[J].AvianDis，1979，23(2)：366-385.

[2]ZHOU W，YANG B，SHEN B，et al.A serologic survey of antibody against chicken infectious anemia virus by indirect immunofluorescent assay in domestic poultry in China[J].AvianDis，1996，40(2)：358-360.

[3]NATESAN S，KATARIA J M，DHAMA K，et al.Biological and molecular characterization of chicken anaemia virus isolates of Indian origin[J].VirusRes，2006，118(1-2)：78-86.

[4]CRAIG M I，RIMONDI A，DELAMER M，et al.Molecular characterization of chicken infectious anemia virus circulating in Argentina during 2007[J].AvianDis，2009，53(3)：331-335.

[5]KIM H R，KWON Y K，BAE Y C，et al.Molecular characterization of chicken infectious anemia viruses detected from breeder and broiler chickens in South Korea[J].PoultSci，2010，89(11)：2426-2431.

[6]ZHANG X，LIU Y，WU B，et al.Phylogenetic and molecular characterization of chicken anemia virus in southern China from 2011 to 2012[J].SciRep，2013，3：3519.

[7]邵红霞，王平平，武敏，等.家禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒 PCR 检测方法的建立[J].中国家禽，2012，34(21)：28-30.

SHAO H X，WANG P P，WU M，et al.A rapid PCR approach for detecting the contamination of chicken anemia virus in avian live vaccines[J].ChinaPoultry，2012，34(21)：28-30.(in Chinese)

[8]王林，陈浩，崔治中.1株鸡传染性贫血病毒野毒株对不同日龄SPF鸡的致病性[J].中国兽医学报，2010，30(2)：188-191.

WANG L，CHEN H，CUI Z Z.Pathogenicity of a chicken infectious anemia virus field isolated in SPF chickens at different ages[J]ChineseJournalofVeterinaryScience，2010，30(2)：188-191.(in Chinese)

[9]AWAD A M，ABD EL-HAMID H S，ABOU RAWASH A A，et al.Detection of reticuloendotheliosis virus as a contaminant of fowl pox vaccines[J].PoultSci，2010，89(11)：2389-2395.

[10]BARBOSA T，ZAVALA G，CHENG S.Molecular characterization of three recombinant isolates of avian leukosis virus obtained from contaminated Marek’s disease vaccines[J].AvianDis，2008，52(2)：245-252.

[11]FADLY A，SILVA R，HUNT H，et al.Isolation and characterization of an adventitious avian leukosis virus isolated from commercial Marek’s disease vaccines[J].AvianDis，2006，50(3)：380-385.

[12]ZAVALA G，CHENG S.Detection and characterization of avian leukosis virus in Marek’s disease vaccines[J].AvianDis，2006，50(2)：209-215.

[13]ZHAO P，DONG X，CUI Z Z.Isolation，identification，and gp85 characterization of a subgroup A avian leukosis virus from a contaminated live Newcastle Disease virus vaccine，first report in China[J].PoultSci，2014，93(9)：2168-2174.

[14]FADLY A，GARCIA M C.Detection of reticuloendotheliosis virus in live virus vaccines of poultry[J].DevBiol(Basel)，2006，126：301-305.

[15]WEI K，SUN Z，ZHU S，et al.Probable congenital transmission of reticuloendotheliosis virus caused by vaccination with contaminated vaccines[J].PLoSOne，2012，7(8)：e43422.

[16]LI J P，DONG X，YANG C H，et al.Isolation，identification，and whole genome sequencing of reticuloendotheliosis virus from a vaccine against Marek’s disease[J].PoultSci，2015，94(4)：643-649.

[17]KOST R，JONES D，ISFORT R，et al.Retrovirus insertion into herpesvirus：characterization of a Marek’s disease virus harboring a solo LTR[J].Virology，1993，192(1)：161-169.

[18]DAVIDSON I，BORENSHTAIN R.Invivoevents of retroiral long terminal repeat integration into Marek’s disease virus in commerial poultry：detection of chimeric molecules as a marker[J].AvianDis，2001，45(1)：102-121.

[19]JONES D，ISFORT R，WITTER R，et al.Retroviral insertions into a herpesvirus are clustered at the junctions of the short repeat and short unique sequences[J].ProcNatlAcadSciUSA，1993，90(9)：3855-3859.

[20]SUN A，LAWRENCE P，ZHAO Y，et al.A BAC clone of MDV strain GX0101 with REV-LTR integration retained its pathogenicity[J].ChinSciBulletin，2009，54(15)：2641-2647．

[21]SUN A J，XU X Y，PETHERBRIDGE L，et al.Functional evaluation of the role of reticuloendotheliosis virus long terminal repeat (LTR) integrated into the genome of a field strain of Marek’s disease virus[J].Virology，2010，397(2)：270-276．

[22]MOORE K M，DAVIS J R，SATO T，et al.Reticuloendotheliosis virus (REV) long terminal repeats incorporated in the genomes of commercial fowl poxvirus vaccines and pigeon poxviruses without indication of the presence of infectious REV[J].AvianDis，2000，44(4)：827-841.

[23]SINGH P，SCHNITZLEIN W M，TRIPATHY D N.Reticuloendotheliosis virus sequences within the genomes of field strains of fowlpox virus display variability[J].JVirol，2003，77(10)：5855-5862.

[24]BISWAS S K，JANA C，CHAND K，et al.Detection of fowl poxvirus integrated with reticuloendotheliosis virus sequences from an outbreak in backyard chickens in India[J].VetItal，2011，47(2)：147-153.

[25]丁家波，崔治中，于立娟，等.含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片段的天然重组禽痘病毒的研究[J].微生物学报，2004，44(5)：588-592.

DING J B，CUI Z Z，YU L J，et al.Detection of reticuloendotheliosis virus genomic sequence in the genome of field and vaccine of fowl poxvirus[J].ActaMicrobiologicaSinica，2004，44(5)：588-592.(in Chinese)

(编辑白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.020

收稿日期：2016-04-10

基金项目：农业部财政项目“禽垂直传播性疾病诊断技术研究”

作者简介：任志浩(1992-)，男，山东青岛人，硕士生，主要从事动物分子病毒学研究，E-mail：zhren92@163.com；房立春(1991-),男，山东济南人，硕士生，主要从事动物分子病毒学研究，E-mail：18854881003@163.com。两人对本研究有同等贡献，为并列第一作者 *通信作者：赵鹏，E-mail：zhaopeng@sdau.edu.cn;常爽，E-mail：changshuang81@126.com。赵鹏、常爽并列通信作者

中图分类号：S852.659.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)07-1459-06

Development and Application of a Quantitative PCR for Detection of Chicken Infectious Anemia Virus Contamination in Attenuated Vaccines

REN Zhi-hao#，FANG Li-chun#，LUAN Huai-biao，LI Yang，WANG Yi-xin，CUI Zhi-zhong，CHANG Shuang*，ZHAO Peng*

(CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

Abstract:To detect the contamination of Chicken infectious anemia virus (CIAV) in attenuated vaccines for poultry，primers and TaqMan probes were designed and synthesized based on the published CIAV genome sequence，and a real-time quantitative PCR method for detecting the CIAV was established by optimizing the reaction conditions.Results analysis showed that the sensitivity of the qPCR may increase detection to 10 copies·μL-1，and the method was approximately 100-fold higher than the sensitivity of the conventional PCR.This detection method had good specificity，and showed no cross-reactions with ALV，REV and MDV genes，the CV (coefficient of variation) of intra-assay and inter-assay were less than 2%，and also showed that the method had the characteristics of better repeatability.In our experiment，a low dosage of 1 EID50·1 000-1plumes and in 2 positive (5.1%) of 39 samples were detected for CIAV detection from commercial poultry vaccines by qPCR method.In this study，suggesting that this method provides a high sensitivity，strong specificity and better repeatability system for detection of a low dosage CIAV contamination in attenuated vaccines.

Key words:chicken infectious anemia virus；real-time PCR；live vaccine；contamination