不同年龄高危HPVE6/E7mRNA检测在ASC-US分流中的应用

潘嫱微　郑小冬　沈晓露　杨杰　张月辉　沙丽晓　吕杰强

325000 温州市人民医院妇产科(潘嫱微、郑小冬、沈晓露、杨杰、张月辉、沙丽晓)；325000 温州医科大学附属第二医院妇产科(吕杰强)



不同年龄高危HPVE6/E7mRNA检测在ASC-US分流中的应用

潘嫱微郑小冬沈晓露杨杰张月辉沙丽晓吕杰强

325000 温州市人民医院妇产科(潘嫱微、郑小冬、沈晓露、杨杰、张月辉、沙丽晓)；325000 温州医科大学附属第二医院妇产科(吕杰强)

【摘要】目的分析HR-HPV E6/E7mRNA检测在不同年龄段无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(ASC-US)患者中的分流价值。方法对320例ASC-US患者同时检测HR-HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA，并行阴道镜检查和宫颈活检，按年龄段分成<30岁组和≥30岁组,进行统计学分析。结果<30岁组和≥30岁组的HR-HPV E6/E7mRNA阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；<30岁组的HR-HPV DNA阳性率明显高于≥30岁组，差异有统计学意义(P<0.05)；<30岁组的CINⅡ+级检出率明显低于≥30岁组，差异有统计学意义(P<0.05)。<30岁组的HR-HPV E6/E7mRNA检测CINⅡ+级的特异度分别为68.0%，显著高于HR-HPV DNA检测的38.7%，差异有统计学意义(P<0.05)；≥30岁组的HR-HPV E6/E7mRNA检测CINⅡ+级的特异度为76.5%，高于HR-HPV DNA检测的69.4%，差异有统计学意义(P<0.05)；<30岁组和≥30岁组两种HPV检测方法诊断CINⅡ+级的灵敏度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)均无统计学差异(均P>0.05)。结论HR-HPV E6/E7mRNA检测比HR-HPV DNA检测更适合用于包括<30岁ASC-US女性是否需要阴道镜转诊的分流管理。

【主题词】乳头状瘤病毒，人；E6/E7mRNA；无明确诊断意义的不典型鳞状细胞；宫颈上皮内瘤样病变；年龄

全世界近四十年的研究结果表明，宫颈癌筛查采用宫颈细胞学检查使宫颈癌的发病率和死亡率逐年下降。液基薄层细胞学检查(thinprepcytologictest，TCT)是一种较先进的宫颈细胞学检查技术,其中无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(atypicalsquamouscellofundeterminedsignificance，ASC-US)在宫颈细胞学诊断结果中约占4%～5%，是最常见的宫颈细胞学异常结果[1]。宫颈脱落细胞中ASC-US的出现受多种因素的影响，包括外界的刺激、宫内节育器的放置、切片固定是否良好、细胞病理实验室的条件以及细胞病理学医生的专业程度等，但同时存在宫颈癌前病变，甚至宫颈癌的可能。据文献报道3%～36%的ASC-US有潜在发展为高级别CIN的风险，两年内发展为宫颈浸润癌的累积风险是0.10%～0.25%[2]。

对于ASC-US阳性者，是先进行人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)检测，还是重复细胞学检查，或直接阴道镜转诊一直存在争议。2012年美国阴道镜和宫颈病理协会(AmericanSocietyforColposcopyandCervicalPathology，ASCCP)等发布的指南[3]中提出，对发现ASC-US者，首先建议进行补充的HPV检测，根据HPV结果决定是否转诊阴道镜检查。HPVDNA检测仅能判断有无HPV感染，却不能揭示病毒的致癌活性。研究普遍显示，HR-HPVDNA检测在ASC-US分流中的灵敏度较高，但特异度欠理想[4]，故其在ASC-US分流中的临床应用价值经常受到质疑，特别是HPV在性生活活跃年龄的年轻女性中感染率更高，故其对年轻ASC-US女性的分流价值更加有限。因此，有必要采取更为有效的分流ASC-US的HR-HPV检测方案。

本研究对 320例ASC-US患者同时用Quan-tivirus法检测HR-HPVE6/E7mRNA和DNA导流杂交基因芯片技术检测HR-HPVDNA，并行阴道镜检查和宫颈活检，以CINⅡ+级为研究终点，比较<30岁组和≥30岁组两种HPV检测方法阳性率与高级别宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)检出率的差异，与HR-HPVDNA检测比较，分析HR-HPVE6/E7mRNA检测在不同年龄段ASC-US患者中的分流价值，力求能够提供ASC-US分流处理中最佳的HPV检测方案。

1资料与方法

1.1研究对象选取2013年10月至2015年4月在温州市人民医院妇科门诊就诊，宫颈癌筛查项目中TCT结果为ASC-US的患者320例。年龄21～65岁，中位年龄37岁，排除有生殖道急性炎症、有宫颈疾病史、有子宫切除手术史或宫颈手术史、有盆腔放射治疗史、妊娠、曾有HPV疫苗注射史、取标本前3d有性生活或阴道冲洗放药史、12月内宫颈细胞学或HPV检测异常者。所有研究对象在了解研究过程后同意加入研究，并签署知情同意书。整个研究过程中，所有研究对象对检测的TCT和HPV结果均不知情。本研究符合伦理学规范，并经温州市人民医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1标本采集：所有受试者取膀胱截石位，由妇科医生用窥阴器暴露宫颈，用棉签擦拭宫颈口分泌物，将TCT专用刷伸入宫颈口，同方向旋转5圈，抽出刷子，将刷子放入TCT保存液中，震动刷子，收集宫颈口与宫颈管脱落细胞，将宫颈脱落细胞标本放入TCT专用保存管保存，注明标号和日期。样本保存后应在4℃存放，并在1月内检测。

1.2.2检测方法

1.2.2.1TCT检测:(1)由细胞病理室专职人员进行操作。将TCT保存液中的部分脱落细胞制成细胞悬液，离心过滤，去除黏液的干扰，制成细胞薄片；(2)用巴氏染色法使细胞着色；(3)本院细胞病理室医生阅片，显微镜下观察分析宫颈上皮脱落细胞形态，按照2001年TBS(theBethesda)分类标准结果为ASC-US。

1.2.2.2HR-HPVDNA检测:采用DNA导流杂交基因芯片技术检测21种HPV亚型，包括13种高危亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)，5种低危亚型(6、11、42、43和44)，与3种常见的亚型(53、66和CP8304)。1种HR-HPV阳性即为阳性。

1.2.2.3HR-HPVE6/E7mRNA检测:采用宫颈稳态检测试剂盒，用Quantivirus法支链DNA杂交捕获的原理，检测14种HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)E6/E7mRNA的表达，可用TCT剩余标本，检测具体步骤见说明书，包括(1)标本漂洗；(2)标本裂解；(3)检测缓冲液配置；(4)布板；(5)信号放大；(6)读板；(7)判读结果，检测结果经电脑计算转换为拷贝数，以拷贝数≥1copy/ml为阳性。

1.2.2.4阴道镜检查及宫颈活检:由阴道镜室护士(其不参与其他试验过程)登记本组患者的一般临床资料、TCT和HPV的检测结果。由本院妇产科阴道镜专科医师(其对患者的TCT和HPV检测结果不知情)对本组患者行阴道镜检查，并对可疑病灶进行定位活检，未见明显异常者行宫颈3、6、9、12点常规活检和宫颈管搔刮。

1.2.2.5病理组织学检查:标本制片由病理科技术人员完成。所有病理切片均由不知HPV和TCT结果的2名高年资病理科医师阅片，诊断标准都参照世界卫生组织分类标准执行。诊断意见不一致者由第3名高年资病理科医师重新阅片再达到一致诊断。根据病理检查结果分为正常/炎症、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈癌。以病理诊断为金标准，以CINⅡ+级(包括CINⅡ级、CINⅢ级和宫颈癌)为研究终点。按年龄段分成<30岁组和≥30岁组。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析。不同年龄段的HR-HPVE6/E7mRNA、HR-HPVDNA阳性率和CINⅡ+级检出率的比较采用χ2检验；两种检测方法对高级别CIN检出的灵敏度、特异度和预测值使用传统列联表计算，其95%可信区间(confidenceinterval,CI)用精确二项式方法计算，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同年龄段ASC-US患者CINⅡ+级检出情况和两种检测方法的阳性结果比较

320例ASC-US患者中<30岁组83例，≥30岁组237例；<30岁组和≥30岁组的HR-HPVE6/E7mRNA阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；<30岁组的HR-HPVDNA阳性率明显高于≥30岁组，差异有统计学意义(P<0.05)；经阴道镜检查及宫颈活检，所有320例患者中，病理结果发现CINⅡ+级62例，占19.4%，<30岁组的CINⅡ+级检出率(8例, 9.6%)明显低于≥30岁组(54例, 22.8%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2不同年龄段两种HPV检测方法对CINⅡ+级的诊断价值

表1　不同年龄段CINⅡ+级检出情况和两种检测方法阳性结果的比较[例(%)]

表2　不同年龄组内两种HPV检测方法对CINⅡ+级诊断的灵敏度、特异度和预测值比较

注： 阳性预测值PPV：positivepredictivevalue

阴性预测值NPV：negativepredictivevalue

<30岁组，HR-HPVE6/E7mRNA检测CINⅡ+级的特异度为68.0%，显著高于HR-HPVDNA检测的38.7%，二者差异有统计学意义(P<0.05)；灵敏度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)与HR-HPVDNA检测相比，均差异无统计学意义(P>0.05)。≥30岁组，HR-HPVE6/E7mRNA检测CINⅡ+级的特异度为76.5%，高于HR-HPVDNA检测的69.4%，差异有统计学意义(P<0.05)；两种HPV检测方法的灵敏度、PPV和NPV均无差异统计学意义(P>0.05)。

3讨论

目前，国内对不同年龄段ASC-US女性分流的HPV检测价值研究的数据有限，在年龄背景下，评估ASC-US的分流管理更加细化了高级别CIN的风险评估，能为临床提供有价值的信息。美国一项61个中心的研究对47 208人进行宫颈细胞学检查，其中ASC-US患者1578例，发现<30岁组和30岁及以上组的HR-HPVDNA的阳性率分别是54.1%和31.3%，差异有统计学意义，各年龄组CINⅡ+级的检出率分别是6.8%和5.5%，差异无统计学意义[5]。WrightJD等和MassadSL等研究发现HR-HPVDNA在ASC-US阳性患者中的阳性率为16%～59%，年轻女性更高，最高达80%，但在这些人群中高级别CIN的检出率仅3%～10%[6,7]。

本研究对320例ASC-US阳性患者的HR-HPVDNA检测结果进行了分析，结果发现<30岁组的HPV感染率高达63.9%，显著高于≥30岁组的43.9%，然而其CINⅡ+级的检出率仅9.6%，明显低于≥30岁组的22.8%，这与文献结果不同，可能与研究例数和不同细胞病理室医生对ASC-US诊断水平差异相关。同时发现<30岁组HR-HPVDNA检测诊断CINⅡ+级的灵敏度为87.5%，特异度为38.7%，可见<30岁组的CINⅡ+级检出率低，但HPV感染率高，其假阳性率也明显升高。WrightJD等研究又发现<30岁的ASC-US女性中HR-HPVDNA检测诊断CINⅡ+级的灵敏度高达100%，特异度仅29.2%[8]，比本研究更低。EinsteinMH等研究发现随着年龄增加，HR-HPVDNA检测诊断高级别CIN的特异度明显升高，灵敏度无统计学差异[9]。以上研究均发现HR-HPVDNA检测在年轻ASC-US女性中对高级别CIN诊断的灵敏度虽然高，但假阳性率即误诊率亦高，与本研究结果相同，均不支持其用于年轻女性的ASC-US分流。

在年轻女性中HPV感染即使是HR-HPV感染,也更具普遍性和短暂性[10]，HPV感染率高，但高级别CIN检出率并未相应增加，HR-HPVDNA检测对高级别CIN诊断的特异度低。同时有研究指出，年轻女性的宫颈病变自行消退几率大[6]，故若HR-HPVDNA检测用于30岁以下女性的ASC-US分流，会使更多的女性转诊阴道镜检查和进一步治疗，然而这部分年轻女性的过度诊疗对其将来的生育等方面影响更大[11]。 因此HR-HPVDNA检测对年轻女性的ASC-US分流价值更加有限，认为年轻女性的ASC-US分流应更倾向于重复的宫颈细胞学检查[6-9]。国际癌症研究机构指出15%的宫颈癌发生在20～34岁女性，故对于年轻的ASC-US女性仅重复筛查宫颈细胞学的效率偏低，但若进行HR-HPVDNA检测又会增加阴道镜转诊率，那该如何为年轻的ASC-US女性提供有足够灵敏度和特异度的分流策略呢？研究指出<30岁女性HPV感染虽然普遍，但病毒转录翻译的概率小[12]。游离的HPVDNA整合入宿主细胞是宫颈疾病进展的关键，整合的HR-HPVDNA会造成负责转录调节的E2区基因缺失，结果导致E2基因对E6和E7基因的负向调控作用缺失，使E6和E7基因表达异常从而导致细胞向恶性转化[13]。HR-HPVE6/E7病毒癌基因会导致细胞不断增殖而失去了修复损伤的能力，进而引起基因重排和突变，甚至非整倍体的发生，从而促进癌症的发生[14]。基于上述这些理论基础，那么表达HR-HPV转录翻译水平的HR-HPVE6/E7mRNA检测就更适合年轻女性的ASC-US分流吗？PierryD等研究发现<30岁组HPVE6/E7mRNA检测对高级别CIN检出的灵敏度、特异度和PPV分别是88%、88%和64%，与重复宫颈细胞学检查的诊断价值相比，两者具有相似的灵敏度和PPV，但前者特异度显著提高，支持HPVE6/E7mRNA检测作为<30岁女性ASC-US分流的首选指标[15]。

本研究发现<30岁组和≥30岁组的HR-HPVE6/E7mRNA阳性率无明显差异，进一步分别分析不同年龄组内两种HPV检测方法对ASC-US的分流价值，发现<30岁组HR-HPVE6/E7mRNA检测CINⅡ+级的特异度为68%，显著高于HR-HPVDNA检测的38.7%，两者灵敏度差异无统计学意义，可见HR-HPVE6/E7mRNA检测保证相似灵敏度的同时，也显著提高了特异度；比较两种检测方法在≥30岁组ASC-US患者的分流作用，也发现两者对CINⅡ+级诊断的灵敏度和预测值均无统计学差异，但HR-HPVE6/E7mRNA检测的特异度明显较高。可以认为，若将HR-HPVE6/E7mRNA检测用于ASC-US的分流，可比HR-HPVDNA检测减少阴道镜转诊率。在不降低灵敏度即高级别宫颈病变的检出率的同时，可以更精确地选择高危人群，减少由过度治疗造成患者一系列的并发症(如生殖道炎症、宫颈管粘连、宫颈机能不全、晚期流产、早产等)，并能减少医疗资源的浪费。

综上所述，相比HR-HPVDNA检测，HR-HPVE6/E7mRNA检测更适合作为包括30岁以下的ASC-US女性是否需要阴道镜转诊的分流策略。HR-HPVE6/E7mRNA检测作为ASC-US的分流指标具有较大的临床应用前景。但限于本研究例数有限，仍需要长期大样本的研究进一步证实其临床价值。

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通信作者：吕杰强，Email:Jieqianglu@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.012

(收稿日期：2015-12-16)

Age-dependentapplicationofhigh-riskHPVE6/E7mRNAtestintriageofASC-US

Pan Qiangwei,Zheng Xiaodong,Shen Xiaolu,Yang Jie,Zhang Yuehui,Sha Lixiao,Lyu Jieqiang

Department of Obstetrics and Gynecology, Wenzhou People′s Hospital,Wenzhou 325000,China; Department of obstetrics and Gynecology, the Second Hospital Affiliated Whenzhou Medical University(Lyu JQ) Corresponding author:Lyu Jieqiang, Email:Jieqianglu@126.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical performance of high-risk human papillomavirus (HR-HPV) E6/E7 mRNA test in female in different groups with atypical squamous cell of undetermined significance (ASC-US) cytology. Methods320 samples from female patients with ASC-US were detected with HR-HPV E6/E7 mRNA test and HR-HPV DNA test simultaneously, patients were examined with colposcopy and cervical biopsy. They were divided into two groups: younger than 30 years and 30 years and older. The statistical analysis were performed. ResultsThere were no statistically significance in the positive rate of HR-HPV E6/E7 mRNA between two groups (P>0.05).In the group aged younger than 30 years, the positive rate of HR-HPV DNA was significantly higher than the group aged 30 years and older (P<0.05),but the prevalence of CINⅡor greater was significantly lower than the other group (P<0.05). In the group aged younger than 30 years, the specificity of HR-HPV E6/E7 mRNA test for detection of CINⅡor greater was 68.0%,which was significantly higher (P<0.05) than that of HR-HPV DNA test 38.7%, meanwhile, the specificity of HR-HPV E6/E7mRNA test for detection of CINⅡor greater was significantly higher (P<0.05) than that of HR-HPV DNA test (76.5% vs 69.4%) in the group aged 30 years and older. There were no statistically significance (P>0.05) in sensitivity, positive predictive value(PPV) and negative predictive value(NPV) between the two tests in each group. ConclusionComparing to HR-HPV DNA test, HR-HPV E6/E7mRNA test is more suitable for triage of ASC-US including female patients who were younger than 30 years.

【Key words】Papillomavirus human；E6/E7mRNA；atypical squamous cell of undetermined significance；cervical intraepithelial neoplasia；age