北京地区市售牡蛎轮状病毒污染调查

高志勇　严寒秋　刘白薇　霍达　李丹地　钱海坤　陈丽娟　王全意

100013 北京市疾病预防控制中心食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室(高志勇、严寒秋、刘白薇、霍达、钱海坤、陈丽娟、王全意); 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(李丹地)



北京地区市售牡蛎轮状病毒污染调查

高志勇严寒秋刘白薇霍达李丹地钱海坤陈丽娟王全意

100013 北京市疾病预防控制中心食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室(高志勇、严寒秋、刘白薇、霍达、钱海坤、陈丽娟、王全意); 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(李丹地)

【摘要】目的调查北京地区市售牡蛎轮状病毒的污染状况。 方法2014年2月至2015年3月，在北京市某大型水产品批发市场采集，每摊位采5只为一组，共56组280只牡蛎。用3种方法对样品前处理：直接处理法、PEG 8 000沉淀法和蛋白酶K消化-PEG 8 000沉淀法。然后利用荧光RT-PCR检测样品的A组轮状病毒核酸，采用半巢式反转录-聚合酶链反应方法对A组轮状病毒核酸阳性进行G、P基因分型。对阳性毒株的VP7和VP4基因进行扩增和测序, 采用Mega 6.06软件构建进化树，建树方法为最大似然法。结果直接处理法、PEG 8 000沉淀法和蛋白酶K消化-PEG 8 000沉淀法3种前处理方法A组轮状病毒检出率分别为3.57%(2/56)、7.14%(4/56)和5.38% (3/56)。56组样品中8组A组轮状病毒核酸检测阳性，检出率为14.29%，均在秋冬季检出。轮状病毒基因型组合型为G9/P[8](2株)和G9/P[N](6株)。3株轮状病毒VP7基因和1株轮状病毒VP4基因成功测序，进化分析显示与近年来我国流行的G9/P[8]型毒株同源性最高。结论北京地区秋冬季市售部分牡蛎存在轮状病毒污染，有引起食源性疾病的风险。

【主题词】牡蛎；A组轮状病毒；半巢式RT-PCR；基因型

Fundprograms:BeijingMunicipalNaturalScienceFoundation(7132045)

A组轮状病毒(GroupArotavirus,RVA)是引起全球5岁以下儿童重症腹泻的最主要病原体，2008年全球估计有45.3万5岁以下儿童死于轮状病毒腹泻[1]。

轮状病毒和诺如病毒是病毒性腹泻的主要病原体，摄入污染的食物或水为主要传播方式之一。已有多个国家和地区报告在牡蛎中检出了诺如病毒，这证实了牡蛎是诺如病毒感染传播的重要载体[2]。牡蛎属于双壳滤食性动物，一般在近海滩涂进行养殖，其在滤食过程需要过滤大量的海水，生产生活污水中含有的诺如病毒可被牡蛎特异性富集。牡蛎富集诺如病毒的机制可能为：其胃肠组织存在类似人类组织血型抗原(Histo-bloodgroupantigen，HBGA)的受体，可以与诺如病毒特异性结合[2]。最近研究认为HBGA亦是轮状病毒的结合受体[3]。泰国、墨西哥等国已有在牡蛎中检出轮状病毒的报告[4-5]。目前我国有3篇文献报告在牡蛎中检出了轮状病毒[6-8]，但并未对检出的轮状病毒进行型别鉴定和进化分析。

2014年2月至2015年3月，我们在北京市某大型水产品批发市场采集了市售鲜活带壳牡蛎，调查A组轮状病毒污染状况，并分析其基因特征，为食用牡蛎的安全风险评估提供科学依据。

1材料与方法

1．1样品来源于2014年2月至2015年3月，每月不定期在北京市某大型水产品批发市场的4个摊位采集样品，每个摊位采5只鲜活牡蛎为一组样品，共56组280只，样品采集后立即送检。

1.2实验室检测

1.2.1样品预处理:用无菌蒸馏水将牡蛎外表污泥清净，打开牡蛎外壳后用无菌剪子和镊子取消化腺组织(以肠腺组织和肠内容物为主)，在无菌平皿中将每组样品剪碎并混匀。每组样品按参考文献[9]采用3种方法进行前处理，方法1(M1)：直接处理法，方法2(M2)：PEG8 000沉淀法，方法3(M3)：蛋白酶K消化-PEG8 000沉淀法。

1.2.2病毒核酸提取和荧光定量PCR检测:预处理后的所有样品，用德国Qiagen公司(QIAampViralRNAMiniKit)病毒核酸提取试剂盒，按说明书进行病毒RNA的提取。用硕世生物科技有限公司轮状病毒(A组)检测试剂盒(荧光探针PCR法)，按说明书进行轮状病毒(A组)RNA的检测，Ct值≤39 且有典型的“S”形曲线判为阳性，否则阴性。3种不同前处理方法的每组样品中，有任意一种荧光PCR法检测结果阳性即判定样品被轮状病毒(A组)污染，同时记录Ct值。

1.2.3A组轮状病毒分型:对A组轮状病毒荧光PCR阳性的, 采用半巢式RT-PCR方法进行轮状病毒G、P分型，引物见文献[10-12]。

1.2.4VP7和VP4基因扩增:采用轮状病毒分型的第一轮分型引物分别对G/P分型第一轮产物进行再次扩增，反应条件同分型第二轮扩增反应。

1.3基因进化分析采用BioEdit(版本7.0.9.0)对序列进行编辑、比对。在GenBank中选择参考株，采用MEGA软件(版本 6.06)构建进化树，建树方法选择最大似然法(maximumlikelihoodmethod)，bootstrap值设置为1 000次。VP7基因建树时核酸替代模型选择Tamura3-parameter(T92)+G，VP4基因建树时选择T92+I。

2结果

2.13种前处理方法轮状病毒荧光PCR结果56组样品中：方法1轮状病毒核酸阳性2件，检出率3.57%；方法2阳性4件，检出率7.14%；方法3阳性3件，检出率5.38%。阳性标本Ct值结果在33.50～38.72之间，详见表1。

2.2牡蛎中A组轮状病毒检出及时间分布56组样品中8组A组轮状病毒核酸检测阳性，检出率为14.29%(8/56)；根据我国的阳历，3-5月为春季，6-8月为夏季，9-11月为秋季，12-次年2月为冬季，A组轮状病毒主要在秋季和冬季检出，检出率分别为33.33%(4/12)和20.00%(4/20)，春夏季未检出。见图1。

表1　轮状病毒阳性样本Ct值和基因分型

图1　轮状病毒检测阳性牡蛎的时间分布Fig.1　The time distribution of rotavirus-positive oysters

2.3A组轮状病毒分型结果对轮状病毒核酸阳性的8组标本进行A组轮状病毒G和P基因型分型。G基因型分型均为G9；P基因型分型有P8和PN(P未分型)；GP分型合并分析有2个型别，2株G9/P[8]和6株G9/P[N]，见表1。

图2　A组轮状病毒VP7基因进化分析(842 bp) Fig.2　Phylogenetic analyses based on VP7 genes of group A rotaviruses(842 bp)

2.4序列分析结果8件核酸阳性标本中，3件VP7基因扩增阳性，1件VP4基因扩增阳性。3个VP7基因序列相似性为98.4%～99.4%。对G9型VP7基因构建进化树，结果显示G9型VP7基因主要来自人和猪，至少可有10个分支，本研究中所得VP7基因序列位于第Ⅰ分支，与我国2011-2012年流行的人源轮状病毒亲缘性最高，见图2。对P[8]型VP4基因构建进化树，结果显示P[8]型VP4基因全部来自人，有3个分支，本研究中所得VP4基因序列属于P[8]b亚型，该亚型近年来在我国及世界其他地区广泛流行，见图3。

图3　A组轮状病毒VP4基因进化分析(625 bp)Fig.3　Phylogenetic analyses based on VP4 genes of group A rotaviruses(625 bp)

3讨论

本研究采集的56组样品中有8组样本A组轮状病毒核酸检测阳性，检出率14.29%，与明红霞等[8]的研究结果相近(约17.50%)，表明牡蛎受轮状病毒污染较为严重。仅在秋季和冬季在牡蛎中检出轮状病毒，而我国秋冬季为A组轮状病毒腹泻的发病高峰[13,14]，两者时间分布一致。A组轮状病毒，依据VP7和VP4抗原性不同，将A组轮状病毒分G和P血清型；依据VP7和VP4基因序列的不同将A组轮状病毒分G和P基因型。A组轮状病毒有27个G基因型和35个P基因型，目前全球主要基因型组合型别为G1/P[8]、G2/P[4]、G3/P[8]、G4/P[8]、G9/P[8][15]。自2011年以来，我国轮状病毒优势基因型已由G3P[8]转为G9P[8](中国疾病预防控中心内部监测报告)。本研究8组样本A组轮状病毒核酸G/P分型2个为G9P[8]，6个为G9P[N]，本研究检测结果与我国病毒性腹泻监测结果相似[13,14]。但有6个样本P基因未能分型，可能牡蛎中轮状病毒含量较低，影响扩增；也可能本研究所用的分型方法没有包括相应型别，本研究所用的P基因分型引物只能分出P[4]、P[6]和P[8]～[11]共6个基因型。G9型VP7基因进化分析显示本研究中所得VP7基因序列与我国2011-2012年流行的人轮状病毒亲缘性最高，VP4基因进化分析显示本研究中所得VP7基因序列属于P[8]b亚型，也是近年来我国优势型别。因而可初步推断牡蛎中检出的轮状病毒和人间流行毒株一致，可能为生产和生活废水污染所致。

研究还显示3种不同的样品前处理方法，检出率不同，前处理方法2(PEG8 000沉淀法)和前处理方法3(蛋白酶K消化-PEG8 000沉淀法)检出率较为接近，前处理方法1的检出率较低。3种前处理方法共检出8组A组轮状病毒核酸阳性，其中有1组样品为前处理方法2和方法3同时检出，其型别均为G9/P[N]。所以为减轻工作量日常监测可选用方法2或方法3。鉴于3种方法对于轮状病毒的检出有一定的互补性，建议在疫情暴发时，为提高疫情溯源的成功率，3种样品前处理方法同时使用。本研究中用硕世生物科技有限公司轮状病毒(A组)检测试剂盒(荧光探针PCR法)，进行轮状病毒(A组)RNA的检测。说明书中结果判断标准为Ct值≤38，线性呈标准的“S”形曲线判为阳性，否则为阴性。由于研究的标本为牡蛎海产品，标本中病毒载量低，因此本研究中将结果判断标准定为Ct值≤39，且有典型的“S”形曲线判为阳性。对阳性核酸，采用半巢式RT-PCR，进行轮状病毒基因分型，9件均为G9，这说明本研究使用的判定标准适用于牡蛎中轮状病毒的检测。

本研究显示市售的牡蛎存在轮状病毒污染，食用牡蛎时存在着轮状病毒感染的风险。应加强相关健康宣教，食用牡蛎时应彻底煮熟。

4参考文献

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通信作者：严寒秋，Email：hqyan907@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.011

基金项目：北京市自然科学基金项目(7132045)

(收稿日期：2015-12-10)

InvestigationofrotaviruscontaminationincommercialoystersinBeijing

Gao Zhiyong, Yan Hanqiu, Liu Baiwei, Huo Da, Li Dandi, Qian Haikun, Chen Lijuan, Wang Quanyi

Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing 100013, China(Gao ZY, Yan HQ,Liu BW,Huo D, Qian HK, ChenLJ,Wang QY);National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and prevention,Beijing 102206, China(Li DD) Corresponding author: Yan Hanqiu, Email: hqyan907@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the rotavirus contamination in commercial oysters in Beijing. Methods Between February 2014 and March 2015, a total of 280 oysters were collected in a large aquatic market in Beijing, and 5 oysters per stall were collected and classified as one sample. The samples were processed using three kinds of methods: direct treatment, PEG (polyethylene glycol) 8 000 precipitation and proteinase K digestion-PEG 8 000 precipitation. Group A rotaviruses were detected by real time RT-PCR, and G/P genotyping was performed using the semi-nested RT-PCR. The VP7 and VP4 genes of positive samples were amplified, sequenced, and the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method with MEGA software (version 6.06). ResultsThe detection rates of group A rotaviruses of three methods (direct treatment, PEG 8 000 precipitation and proteinase K digestion-PEG 8 000 precipitation) were 3.57% (2/56), 7.14% (4/56) and 5.38% (3/56), respectively. Rotaviruses were detected in 8 oysters samples (14.29%), which were collected during autumn and winter. The G/P genotype combination included G9/P[8] (2 strains) and G9/P[N] (6 strains). The VP7 genes of 3 strains and the VP4 gene of one strain were sequenced successfully, and the phylogenetic analyses demonstrated that these strains had the highest similarity to those G9/P[8] strains prevailing in recent years in China. ConclusionGroup A rotaviruses were detected in some commercial oysters during autumn and winter in Beijing, indicating a risk of foodborne illness.

【Key words】Oyster; Group A rotavirus; Semi-nested RT-PCR; Genotype