人乳头状瘤病毒L1壳蛋白表达与宫颈病变程度相关性研究

高家良　陈文虎　孙爱华

315040 宁波市鄞州人民医院(高家良)；310053 杭州，浙江医学高等专科学校(陈文虎、孙爱华)



人乳头状瘤病毒L1壳蛋白表达与宫颈病变程度相关性研究

高家良陈文虎孙爱华

315040 宁波市鄞州人民医院(高家良)；310053 杭州，浙江医学高等专科学校(陈文虎、孙爱华)

【摘要】目的探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染宫颈上皮细胞L1壳蛋白表达对宫颈病变的进展及宫颈癌的发生的临床意义。方法病例组共259例，根据液基薄层细胞检测(TCT)结果不同分为未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)103例、非典型鳞状细胞(ASCUS)91例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)36例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)23例和鳞状细胞癌(SCC)6例。同时选择50例健康体检者作为对照组。分别用PCR-反向点杂交法检测HPV 23种亚型和免疫细胞化学法检测L1 壳蛋白表达。结果对照组PCR和L1壳蛋白表达结果均呈阴性。病例组NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者HPV感染率分别为23.3%、69.2%、83.3%、87.0%和100%，HPV-PCR阳性上述患者高危型HPV(HR-HPV)的构成比分别为79.2%、92.1%、96.7%、100%和100%。NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者HPV L1 壳蛋白表达阳性率分别为25.2%、31.9%、63.8%、17.4%和0%。结论随宫颈病变的进展HPV感染率和HR-HPV构成比升高，提示本地区HPV感染率和HR-HPV构成比与宫颈上皮内瘤变程度密切相关。L1壳蛋白检测阳性率随病变早期表达呈上升趋势，晚期呈明显下降，HPV L1壳蛋白的表达与宫颈病变程度有关，可以作为宫颈癌癌前病变的随访指标。

【主题词】乳头状瘤病毒，人；L1壳蛋白；免疫细胞化学；宫颈肿瘤

宫颈癌是临床最常见的妇科恶性肿瘤之一，其形成前有一段较长时间的癌前病变期[1, 2]。文献报道绝大多数宫颈低度鳞状上皮内病变(LSIL)和部分高度鳞状上皮内病变(HSIL)会自然消退，仅少数进展到癌[3-5]。因此早期诊断便于采取针对性治疗措施有利于降低宫颈癌的发生率[6]。人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)特别是高危型HPV(HR-HPV感染是是宫颈上皮癌变的重要危险因子素[2, 7,8]，L1蛋白为HPV感染复制早期的结构蛋白，HPV不同感染期，宫颈上皮内瘤变程度不同，L1蛋白表达存在差异[4-6]，提示检测L1蛋白表达可预测宫颈病变严重程度。本研究采用免疫细胞化学法检测HPVL1壳蛋白在不同宫颈病变脱落细胞中的表达特点，并对其临床意义进行了探讨。

1资料与方法

1.1调查对象2013 年1月—2015年6月由宁波市鄞州人民医院妇科采集的259例宫颈病变病例脱落细胞标本作为病例组，年龄18～74岁，平均36±10岁。259例病例组患者参考国际癌症协会推荐的TBS(2001)分类标准按宫颈薄层液基细胞学(TCT)检查结果分为：未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)103例，非典型鳞状细胞(ASC)91例、LSIL36例、HSIL23例和鳞状细胞癌(SCC)6例。对照组50例健康体检者年龄20～60岁，平均31±7岁。研究通过宁波市鄞州市人民医院伦理委员会审查。

1.2标本采集所需宫颈脱落上皮细胞标本由妇科医生按标准规范采集，检测对象均留取两份标本，其中一份用于PCR-反向点杂交法检测HPV23种亚型，另一份用于免疫细胞化学法检测。如不能及时检测可低温保存。

1.3PCR-反向点杂交法检测PCR检测试剂盒(深圳亚能公司生产)，按试剂盒说明设置空白对照、阴性对照、阳性对照并判断结果。l8个高危型：HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和MM4型；5个低危型包括HPV6、11、42、43和44型。

1.4HPVL1壳蛋白表达免疫细胞化学法检测L1 壳蛋白的表达，试剂盒(美国Advanced公司生产)，按说明书操作。有1个脱落细胞的细胞核被染红(病变细胞核)存在即为HPVL1壳蛋白阳性。

1.5统计学方法应用统计软件SPSS13.0对相关数据进行统计学分析处理，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1HPV感染检测与分型见表1。50例对照组标本PCR-反向点杂交法检测结果全部阴性。病例组HPV阳性率为55.2%(143/259)HPV感染率明显高于正常对照组(P<0.01)。病例组NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者HPV感染率分别为23.3%、69.2%、83.3%、87.0%和100%。统计学分析结果显示HPV感染率NILM患者明显低于病变程度较重的其余各病例组(P<0.01)，ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者宫颈病变的级别提高和瘤变程度加重HPV感染率逐步增高，但差异无统计学意义(P>0.05)但。HPV阳性的NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC患者存在HR-HPV感染的病例，包括HR-HPV和LR+HR-HPV混合感染，NILM和ASCUS患者HR-HPV感染构成比分别为79.2%和93.7%，而所有PCR检测结果为阳性的LSIL、HSIL和SCC患者均存在高危型HPV感染。统计分析发现NILM患者HR-HPV感染率明显低于其他病例组(P<0.05)。提示HR-HPV感染率与宫颈病变及宫颈上皮内瘤变程度密切相关，对患者进行HPV分型检测可用来评估其患宫颈癌的风险和为临床提供一定诊治依据。

2.2L1壳蛋白表达50例对照组标本L1壳蛋白表达结果均呈阴性。病例组 82例标本L1壳蛋白表达阳性，其中NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC患者L1壳蛋白表达阳性率分别为25.2%、31.9%、63.8%、17.4%和0.0%。NILM和ASC组患者间L1壳蛋白表达阳性率无统计学差异(P>0.05)，LSIL组患者L1壳蛋白表达阳性率明显高于其余各组(P<0.01)。NILM、ASCUS和LSIL患者L1壳蛋白表达阳性率提示病变早期阳性率逐步增高，而LSIL、HSIL和SCC患者L1壳蛋白表达阳性率变化则说明感染晚期L1壳蛋白表达阳性率呈现逐步降低，病变组特别是病变早期L1壳蛋白表达阳性率25.2%～63.8%不等，但对照组HPV-PCR和L1壳蛋白表达全部呈阴性，提示L1壳蛋白表达检测能够判断HPV的复制状态，还可以作为宫颈早期病变的诊断标志。

表1　PCR检测HPV感染结果

3讨论

宫颈鳞状上皮内病变发生及发展与HPV感染密切相关。HPV清除则病变消退[4-6]。随着荧光PCR检测HPV技术的建立和成熟，已经有越来越多的研究者利用HPV特别是HR-HPV检测来辅助诊断宫颈病变[2, 8-9]。本研究50例正常体检者HPV全部阴性，而NILM到SCC患者HPV感染率23.3%～100%，提示PCR检测宫颈病变患者HPV感染特异性好。不同病变程度宫颈病变患者HPV感染率都明显高于正常体检者，且随瘤变感染率逐步上升，HPVHR-HPV构成比从NILM的79.2%到HSIL和SCC的100%，随瘤变进展HR-HPV构成比逐步增高。证实HPV感染率和HR-HPV构成比与宫颈瘤变程度密切相关。课题组先前的研究也提示荧光PCR检测HPV不仅有高度特异性也有高度的灵敏度[2, 8]。

荧光PCR能用于检测HPV感染，但不能检测潜伏期，也不能区分HPV是否复制和整合，特别不能区别持续感染、亚临床感染或者临床相关感染，不能直观比较病变细胞的形态变化[2, 4, 9]。文献报道L1蛋白为HPV感染复制早期的结构蛋白，L1壳蛋白有利于激发人体细胞免疫清除感染的细胞保护机体。宫颈癌时Ll壳蛋白表达率极低或不表达，而在宫颈良性病变时表达率较高[4-6,9]。本研究中，L1壳蛋白表达照组标本全部阴性，而病例组标本有25.2%～63.8%不等的阳性率，提示L1壳蛋白表达确实与HPV感染有关；另外分析不同病变期宫颈病变标本发现，从NILM发展LSIL，L1壳蛋白表达从25.2%增高到63.8%，提示L1壳蛋白表达能区分病毒潜伏和复制，病毒感染初期检测L1蛋白表达可预测早期宫颈病非瘤性病变进展。研究者认为感染后期HPV整合到宿主DNA，随宿主细胞分裂，L1壳蛋白表达下降甚至表达缺失[4-6, 10]，本研究发现LSIL、HSIL和SCC患者L1壳蛋白表达阳性率从63.8%、17.4%和0%，随着进展L1壳蛋白表达阳性率呈显著下降，提示L1壳蛋白表达能区分病毒复制和整合，检测L1蛋白表达可预测宫颈瘤变严重程度。

HPV感染后不同时期HPVL1壳蛋白的表达差异提示，利用L1壳蛋白的表达差异可预测宫颈上皮内瘤变的生物学行为。因此L1壳蛋白可以作为诊断宫颈癌前病变的一个良好指标。

4参考文献

[1]FormanD,deMartelC,LaceyCJ,etal.Globalburdenofhumanpapillomavirusandrelateddiseases.Vaccine, 2012, 30:F12-23.doi: 10.1016/j.vaccine.2012.07.055.

[2]LiuXX,FanXL,YuYP,etal.Humanpapillomavirusprevalenceandtype-distributionamongwomeninZhejiangProvince,SoutheastChina:across-sectionalstudy.BMCInfectDis, 2014, 14:1-7.doi: 10.1186/s12879-014-0708-8.

[3]SalazarKL,ZhouHS,XuJ,etal.Multiplehumanpapillomavirusinfectionsandtheirimpactonthedevelopmentofhigh-riskcervicallesions.ActaCytol,2015, 59:391-398.doi: 0.1159/000442512.

[4]LeeH,LeeKJ,JungCK,etal．ExpressionofHPVLIcapsidproteinincervicalspecimenswithHPVinfection．DiognCytopathol, 2008, 36:864-867.doi:10.1002/dc.20922.

[5]XiaoW,BianM,Mal,etal.ImmunochemicalanalysisofhumanpapillomavirusL1capsidproteininliquid-basedcytologysamplesfromcervicallesions.ActaCytol, 2010, 54:661-667.

[6]SchmidtD.Precancerouslesionsofthecervix.Biomarkersincytologicaldiagnosis.Pathologe, 2011, 32:484-490.doi: 10.1007/s00292-011-1478-3.

[7]BruniL,DiazM,CastellsaguéX,etal.Cervicalhumanpapillomavirusprevalencein5continents:meta-analysisof1millionwomenwithnormalcytologicalfindings.JInfectDis, 2010, 202:1789-1799.doi: 10.1086/657321.

[8]俞春松, 江敏敏, 刘小香, 等. 浙江省嘉兴地区健康和宫颈病变妇女人乳头瘤病毒感染情况分析. 中华实验和临床病毒学杂志, 2014, 28:339-341.doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.

[9]AndersonL,O′RorkeM,JamisonJ,etal.PrevalenceofhumanpapillomavirusinwomenattendingcervicalscreeningintheUKandIreland:newdatafromnorthernIrelandandasystematicreviewandmeta-analysis.JMedVirol, 2013, 85:295-308.doi: 10.1002/jmv.23459.

[10]StanleyM．Immuneresponsetohumanpapillomavius.Vaccine, 2006, 24：S16-S22．doi:10.1016/j.vaccine.

通信作者：孙爱华，Email: sunah123@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.009

基金项目：浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目

(收稿日期：2015-10-18)

RelationshipresearchbetweenexpressionofHPVL1capsidproteinandcervicallesionsdegree

Gao Jialiang, Chen Wenhu, Sun Aihua

Yinzhou People’s Hospital, Ningbo 315040, China(Gao JL); Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China(Chen WH, Sun AH) Corresponding author: Sun Aihua, Email: sunah123@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical significance of the expression of Ll capsid protein in cervical lesion cells infected with human papillomavirus (HPV), for the prevention of cervical cancer and suggestion of progression and probability of potential lesions. Methods259 different levels of cervical lesion patients were patients group, including 103 cases negative for intraepithelial lesion and malignancy (NILM), 91 cases with atypical squamous cells of undetermined significance(ASCUS)，36 cases with low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), 23 cases with high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL), and 6 cases with squamous cell carcinoma (SCC). Cervical cell samples of 50 normal physical examination people were control group. Immunohistochemical staining for Ll capsid protein and PCR-based reverse blot hybridization for 23 HPV DNA were employed．ResultsBoth Ll capsid protein detection and PCR -based reverse blot hybridization detection were negative in the control group．The infection ratio of HPV were 23.3%, 69.2%, 83.3%, 87.0% and 100% in woman with NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC, respectively. The constituent ratio of high-risk HPV (HR-HPV)were 79.2%, 92.1%, 96.7%, 100% and 100% in HPV positive patients with NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC, respectively. The positive rates of HPV Ll capsid protein in NILM, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC were 25.2%, 31.9%, 63.8%, 17.4% and 0.0%, respectively. ConclusionsBoth infection ratio of HPV and constituent ratio of HR-HPV were increased gradually with the aggravation of cervical lesions, and the infection ratio of HPV and constituent ratio of HR-HPV were closely related to the degree of cervical diseases. The detection results of Ll capsid protein were on the rise in the early phase of cervical lesion，however，declining in the late phase of cervical lesion, the expression of HPV Ll capsid protein associates with the degrees of cervical lesion, which may serve as an indicator of cervical precancerous lesions of the follow-up.

【Key words】Papillomavirus, human; Ll capsid protein; Immunohistochemical staining; Cervical cancerFund programs: Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health talents