剪接因子SF3a3通过PI3K-Akt信号传导通路调控丙型肝炎病毒的复制

董晓琴　李亚茹　成军　赵鸿

100034 北京大学第一医院感染疾病科(董晓琴、赵鸿)；100015 首都医科大学附属北京地坛医院(李亚茹、成军)



剪接因子SF3a3通过PI3K-Akt信号传导通路调控丙型肝炎病毒的复制

董晓琴李亚茹成军赵鸿

100034 北京大学第一医院感染疾病科(董晓琴、赵鸿)；100015 首都医科大学附属北京地坛医院(李亚茹、成军)

【摘要】目的研究剪接因子SF3a3(Splicing factor 3,subunit 3, SF3a3)在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)复制中的作用并初步探索其机制。 方法以基因2型HCV病毒株(JFH1)感染的Huh7.5.1细胞(肝癌细胞株)为研究平台，用siRNA技术沉默基因SF3表达，72 h后感染JFH1 24 h，用PEG-IFNα-2b(30 IU/ml)处理48 h，用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及免疫印迹(Western Blot)技术研究SF3家族成员与HCV 核心蛋白、干扰素信号通路蛋白间的相互作用。结果在mRNA和蛋白表达水平上，特异性siRNA对SF3a3的沉默效果最佳；沉默SF3a3后，HCV核心蛋白表达增强；同等PEG-IFNα-2b压力下，干扰素抗HCV的作用受抑制；而PI3K-Akt总蛋白和磷酸化蛋白表达降低。结论SF3a3可通过下调PI3K-Akt总蛋白和磷酸化蛋白表达，直接和间接促进HCV复制。

【主题词】剪接因子3a3；肝炎，丙型；聚乙烯二醇类；PI3K-Akt通路

Fundprograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81170386)

全球约有1.85亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)，每年死于HCV相关的肝硬化、肝癌等的人数超过3.5万[1,2]。借助于宿主细胞中的成分，HCV得以完成其生活周期、合成新的病毒粒子并释放入血。Pre-mRNA经剪接体的加工形成为成熟mRNA。剪接体由小核糖核酸蛋白(smallnuclearribonucleoproteinparticles，snRNPs)和非snRNPs组成[3]。U2型剪接体是哺乳动物的主要剪接体，其中剪接因子3(splicingfactor3，SF3)为其主要组分[4]。研究发现：SF3家族成员(SF3a3、SF3b2、SF3b5、SF3b14)[5]参与了干扰素抗HCV的作用。为进一步研究SF3、HCV复制和PEG-IFNα三者间的相互作用，我们以JFH1(基因2型HCV病毒株)感染的Huh7.5.1细胞(肝癌细胞株)为研究平台，用siRNA技术沉默SF3表达，发现SF3a3可能通过PI3K-Akt通路调控HCV的复制。

1材料与方法

1.1实验材料

表1　Real-time PCR所用引物序列

1.1.1细胞、试剂：肝癌细胞株Huh7.5.1由TheScrippsResearchInstitute惠赠。SmallinterferingRNA(siRNA)targetingSF3a3、SF3b2、SF3b5、SF3b14购自德国Dharmacon公司；non-targetingsiRNA和HiPerFectTransfectionReagent购自Qiagen公司。WesternBlot所用一抗购自CST公司；抗-SF3a3，抗-HCVcore购自美国Abcam公司。Real-timePCR试剂盒(PowerSYBR®GreenPCRMasterMix)购自美国ABI公司；q-PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养： 用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM培养液，于37℃、5%CO2孵箱中培养Huh7.5.1细胞。

1.2.2基因沉默: 用1×siRNAbuffer将20μmol/L的siRNA原液稀释为2μmol/L的稀释液，同时按1:50比例稀释HiPerFect转染试剂。6孔板中每孔加入120μlsiRNA稀释液和400μl稀释后的HiPerFect转染试剂，离心1000rpm、1min，室温静置10min。加入Huh7.5.1细胞混悬液(60000/ml)，室温放置30min后移入细胞孵育箱培养72h。

1.3PEG-IFNα-2b处理JFH1感染细胞PEG-IFNα-2b以30IU/ml浓度处理JFH1感染的细胞模型。

1.3.1实时荧光定量PCR(Real-timePCR)：根据PrimeScriptTMRTreagentKit(PerfectRealTime)逆转录试剂盒操作说明书将RNA逆转录为cDNA。以上述cDNA为模板，根据PowerSYBR®GreenPCRMasterMix操作说明书，使用ABI7500荧光定量PCR仪，PCR分别扩增目的基因SF3a3、JFH1。以β肌动蛋白(β-actin)作为Real-timePCR的内参，Real-timePCR产物的计算采用相对定量法，即2-ΔΔCT法。引物序列见表1。

1.3.2Westren-Blot检测:用蛋白酶裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，电泳、转膜、封闭、与一抗和二抗孵育，按ECL说明书进行显色操作，成像仪下曝光显影，保存图像。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，两组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1SF3a3与干扰素和HCV间的相互作用特异性siRNA部分沉默Huh7.5.1细胞中SF3a3的表达72h，加入JFH1病毒液作用24h，用30IU/ml的PEG-IFNα-2b处理48h。提取蛋白、行免疫印迹检查发现：PEG-IFNα-2b可明显下调HCV核心蛋白的表达(图1第4vs3道、第8vs7道)，但不影响SF3a3蛋白的表达(图1第1vs2道、第5vs6道)。在PEG-IFNα-2b的同等压力下，部分沉默SF3a3表达将导致HCV核心蛋白表达的明显上调(图1第4vs8道)，提示部分沉默SF3a3将导致干扰素抗HCV作用的降低。而HCV可明显下调SF3a3的蛋白表达(图1第1vs3道、第5vs7道)。

图1　SF3a3和PEG-IFNα-2b及HCV间的相互作用。特异性siRNA沉默Huh7.5.1细胞中SF3a3基因表达72 h后，加入JFH1病毒液作用。感染后24 h用30 IU/ml的PEG-IFNα-2b处理48 hFig.1　Interaction between SF3a3, PEG-IFN-α, and HCV replication. Huh7.5.1 cells were reverse transfected with siRNA targeting SF3a3 for 72 hours and then were infected with JFH1. PEG-IFNa-2b was added at 30 IU/ml 24 h post infection. Whole cell lysates were harvested 48 hours after treatment. INF, PEG-Interferon α-2b; CORE, HCV core protein; SF3a3, splicing factor 3a3

图3　部分沉默SF3a3可下调PI3K-Akt的表达.针对SF3a3的特异性siRNA转染Huh7.5.1细胞48 h后，加入JFH1病毒液.72 h时用PEG-IFNα-2b(30 IU/mL)处理48 h.收集细胞、裂解，免疫印迹法检测蛋白表达水平。STAT1和p38 MAPK蛋白的表达水平不受影响(a、b)，而PI3K和AKT蛋白表达下调(c，4 vs 8)、磷酸化PI3K/Akt也降低(d，1 vs 3、2 vs 4)Fig.3　Silencing SF3a3 decreased PI3K and Akt protein expression. Specificity siRNA was used for silencing SF3a3 gene expression in Huh7.5.1 cells for 72 hours. PEG-IFNa-2b was added after 24 hours’ JFH1 infection. Cell lysates were obtained after 48 hours’ therapy. INF, PEG-Interferon α-2b; CORE, HCV core protein; SF3a3, splicing factor 3a3

2.2部分沉默SF3a3促进HCV复制为进一步研究SF3a3基因与HCV复制的相关性，遂以JFH1感染Huh7.5.1细胞为研究平台，以免疫印迹法比较SF3a3正常表达和表达缺陷时HCV核心蛋白的变化。发现：SF3a3被部分沉默后、HCV核心蛋白表达上调(图1第3vs7道，图2)。这一作用与我们之前对SART1的研究结果相似(图2)。这些结果提示：部分沉默SF3a3的表达导致HCV核心蛋白表达上调。

图2　部分沉默SF3a3可上调HCV核心蛋白的表达。第一道为阴性对照siRNA、第二道为特异性沉默SART1、第三道为特异性沉默SF3a3Fig.2　Silencing SF3a3 increased HCV core expression. Lane1, negative control. Lane2, siRNA targeting SART1. Lane 3, siRNA targeting SF3a3. SART1, Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells; SF3a3, splicing factor 3a3; CORE, HCV core protein

2.3SF3a3通过PI3K-Akt信号传导通路调控HCV复制为进一步研究SF3a3抑制干扰素抗HCV作用的机制，我们以JFH1感染的Huh7.5.1细胞为研究平台，比较SF3a3正常表达和部分被沉默后、干扰素信号通路蛋白的变化。发现：STAT1和p38MAPK蛋白的表达水平不受影响(图3a、b)，而PI3K和AKT蛋白表达下调(图3c，4vs8)、磷酸化PI3K/Akt也降低(图3d，1vs3、2vs4)。同时，免疫印迹结果提示：没有干扰素的压力下，部分沉默SF3a3同样可下调PI3K和AKT蛋白(图3c，3vs7)。因此，部分沉默SF3a3可下调PI3K-Akt总蛋白和磷酸化蛋白的表达，抑制干扰素抗HCV作用并促进HCV复制。

3讨论

我们的研究发现：沉默SF3a3可下调PI3K-AKT的蛋白表达水平，抑制干扰素的抗HCV作用、同时促进HCV核心蛋白的表达。

SF3a3是剪接因子3a的3个组成成分之一。在Hela细胞中的研究发现，SF3a的每个亚基都是剪接前体成功组装所必须的[6]。用RNAi技术分别沉默Hela细胞SF3a中的3个亚基，发现SF3a单个亚基的减少会引起内源pre-mRNA的积累和相应的mRNA减少或mRNA完全缺失，进而影响细胞存活[7]。XiaoqinYuan等报道Jurkatcells在热压力诱导下，分析核内蛋白变化，发现剪接因子SF3a3和U2AF35表达下降，这可能是热压力诱导机体基因转录和翻译受抑制，细胞周期、增殖及生存能力受限制，最终导致细胞走向凋亡的机制[8]。

PI3K-Akt信号通路主要负责细胞增殖与存活和胰岛素信号转导[9]。许多病毒在感染细胞的过程中也会激活这条通路，包括HCV[10,11]。有研究认为HCV通过激活PI3K-Akt通路抑制细胞凋亡，促进病毒感染细胞的存活，从而有利于病毒的持续复制[12]。Mannova等[13]发现：在HCV复制子细胞中，PI3K-Akt连同其下游蛋白mTOR激活增加；抑制PI3K-Akt通路活性则促进HCV复制。这种作用可能与选择性mRNAs的修改后翻译效率有关；或者与涉及HCV复制的病毒蛋白磷酸化水平改变有关[14,15]。我们的研究发现，部分沉默SF3a3后，Akt总蛋白和磷酸化蛋白表达下调、HCV复制增强，提示SF3a3可能通过调控PI3K-Akt信号通路、直接促进HCV复制。我们的研究同时发现：沉默SF3a3不影响干扰素的经典信号通路和p38MAPK通路蛋白的表达，但可通过下调PI3K-Akt蛋白表达使干扰素抗HCV作用受抑制，间接促进HCV复制。

综上所述，沉默SF3a3可下调PI3K-Akt总蛋白和磷酸化蛋白的表达，促进HCV复制、同时也抑制干扰素的抗HCV的作用。这一发现为抑制HCV复制、增强干扰素抗HCV作用带来新思路。

4参考文献

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通信作者：赵鸿，Email: minmin2001@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.008

基金项目：国家自然科学基金(81170386)

(收稿日期：2015-09-25)

Splicing factor SF3a3 inhibits hepatitis C virus replication through PI3K-Akt pathway

DongXiaoqin,LiYaru,ChengJun,ZhaoHong

DepartmentofInfectiousDiseases,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China(DongXQ,ZhaoH);BeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100015,China(LiYR,ChengJ)Correspondingauthor:ZhaoHong,Email:minmin2001@126.com

【Abstract】ObjectiveWe sought to determine whether SF3a3 was capable of inhibiting HCV replication and to investigate the possible mechanisms. MethodsUsing the infectious HCV clones JFH1, we performed siRNA knockdown in Huh7.5.1 cells. First, we performed small interfering RNA (siRNA) to knock down SF3 gene expression. After 72 h incubation, Huh7.5.1 cells were infected with JFH1 for 24 h and then treated with 30IU/ml PEG-IFNα-2b for 48h. Members of SF3 family, HCV core and the key proteins of the IFN relative pathways were monitored by real time PCR and Western blot. ResultsSF3a3 mRNA level and protein expression were significantly decreased by SF3a3 specific siRNA compared with non-targeting siRNA, whose silencing effect was the best compared with other members of SF3a3 family; knockdown of SF3a3 protein expression by siRNA rescued HCV core expression, inhibited the role of interferon in anti-HCV infection under the same PEG-IFNα-2b pressure, and downregulated the phosphorylation of PI3K and Akt, as well as their total protein levels. ConclusionsSilencing SF3a3 by specific siRNA could downregulate the expression of PI3K-Akt and p-PI3K/p-Akt proteins, which promoted the HCV replication.

【Key words】Splicing factor, SF3a；Peglated Interferon-α，PEG-IFN-α；Hepatitis C virus，HCV；PI3K-Akt pathway