青海湖周边家禽相关环境标本中H5N1亚型禽流感病毒特征分析

董婕　董丽波　张烨　薄洪　黄维娟　王大燕　舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫生部医学病毒和病毒病重点实验室。



青海湖周边家禽相关环境标本中H5N1亚型禽流感病毒特征分析

董婕董丽波张烨薄洪黄维娟王大燕舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫生部医学病毒和病毒病重点实验室。

【摘要】目的了解我国青海湖周边家禽中分离到的高致病性H5N1亚型禽流感病毒的抗原性和基因特性。 方法将青海湖周边野鸟和家禽的环境标本采集处理后，接种SPF鸡胚分离病毒，将红细胞凝集阳性的标本通过real-time RT-PCR进行型别鉴定和亚型分析。将H5N1检测阳性的标本选取部分进行二代序列分析和抗原性分析。 结果2013年1-9月间采集的家禽相关环境标本中共分离到19株高致病性H5N1亚型禽流感病毒，集中在1-3月。对7株病毒进行了全基因组序列分析和抗原性分析显示，血凝素基因进化树显示其中除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013属于clade7.2 分支病毒以外，其余6株属于clade2.3.2.1c分支。神经氨酸酶基因也显示该毒株与其他6株分属于两个不同的分支；抗原分析显示该毒株与所有参考血清低反应，另外6株病毒是A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的类似株。 结论青海湖周边地区在2013年1-3月环境相关标本中检测到高致病性H5N1亚型禽流感病毒，属于clade2.3.2.1和clade7.2 分支病毒。这种高致病性H5N1亚型禽流感病毒多个分支共同流行的趋势提示加强这一地区野鸟和家禽相关环境病原体监测的重要性。

【主题词】高致病性禽流感；H5N1亚型；进化分析；抗原分析

Fund programs: National Basis Research Program(973) of China "Replication mechanisms of important influenza viruses in different hosts"(2011CB504704)

高致病性H5N1亚型禽流感病毒中以A/Goose/Guangdong/1/96为进化起源的一系列病毒在2003年再发以来，在全球多个国家感染野鸟、引起禽类的暴发，并且偶有人类发病。由于这类病毒血凝素(HA)基因进化多样性突出，世界卫生组织(WHO)、世界粮农组织、世界动物卫生组织联合工作委员会统一将高致病性H5N1亚型禽流感病毒的进化分支进行命名，目前共有10个分支(clade 0-9)[1]，其中clade 0、1、2和7感染过人。截止到2015年11月13日，全球共确诊884个病例涉及16个国家，其中449例死亡(病死率51%)[2]。

在我国青海湖地区，2005年4月末到6月发生大规模的野鸟死亡，大约有10 000只。疫情是由野鸟感染高致病性禽流感H5N1亚型病毒引起。该病毒属于clade 2.2[3]. 这类病毒于2006—2009年间陆续在蒙古、俄罗斯、德国、埃及、尼日利亚被发现并且导致野鸟的死亡。尽管这类病毒分布较广，但是在中国鲜有在家禽中感染造成疫情暴发的报道。

随后2009年5、6月间和2010年在青海湖地区又发现野鸟死亡，这次是由于高致病性H5N1的clade 2.3.2病毒感染引起。这次引起暴发的病毒在基因进化上与中国香港和日本野鸟中分离的病毒同源性高，但是缺乏直接证据说明病毒是由野鸟经东亚迁徙途径来到青海湖[4]。

我国高致病性禽流感H5N1病毒在动物间存在着clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2三个优势分支病毒。青海湖地区野鸟中H5亚型病毒分布和家禽的感染状况是我们关注的公共卫生问题。本实验室在2013在青海湖核心区和邻近的地区开展了全年环境监测，希望了解这一地区的禽流感H5N1病毒分布及病原学特征。

1材料与方法

1.1标本采集和处理标本采集于2013年1-9月间，标本采集场所除青海湖核心区域外，还包括了西宁市、海晏县、乐都县部分活禽市场、养殖场及散养户[9]。标本类型包括禽类粪便，被禽类及其粪便沾染的水和环境物体表面。标本采集液配方参考WHO发布的《WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance 2006》[5]，采样前1～2 d配制采样液冷链运输到现场，用无菌拭子挑取5 g左右的新鲜的粪便或者10 ml水样加到采样管里低温运输到实验室。将环境样本离心(3 000 rpm，15 min)，取上清分装保存，并且编号记录。活病毒操作活动均在BSL-3实验室完成。

1.2 病毒的鸡胚分离将处理好的标本，接种9～10日龄SPF鸡胚，37℃恒温培养箱培养48 h。冷胚后收获鸡胚尿囊液。血凝实验测定病毒的滴度。鸡胚接种方法及血凝实验方法参见上述WHO发布的手册。

1.3核酸检测将病毒分离血凝阳性的分离物用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法进行检测，引物和探针为WHO公布的针对甲型流感病毒M基因的通用引物和探针。将Ct值≤30的定义为阳性，对于甲型流感阳性的分离物，用real time RT-PCR方法进行H5以及N1，N2亚型鉴定。

1.4二代测序技术进行序列测定利用Ion TorrentTM测序平台进行序列测定。提取病毒基因组RNA，以U12反转录引物生成单链cDNA，酶切作用使单链cDNA片段化，然后经末端修复和与特异性接头连接，变性处理后形成单链DNA，经过油包水过程实现每个片段在自己的微环境内PCR扩增。纯化后文库定量，然后按照Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit(Cat. No. 4480974)说明书将定量的文库加入，上机测序。

1.5进化分析用MEGA 5.0软件的Clustal W方法进行序列的比对，采用Neighbor-Joining方法进行种系进化分析，选择1000次重复抽样检测。

1.6抗原性分析通过红细胞凝集抑制(Hemagg-lutination Inhibition, HI)实验进行流感病毒的抗原性分析[5]。当待检病毒与参考雪貂抗血清的HI效价低于参考病毒与参考抗血清自身HI效价的8倍(含8倍)或以上时，则认为待检病毒是该参考抗血清检测到的低反应株；反之，当相差8倍以内时(不含8倍)，则认为待检病毒是参考病毒的类似株。所用标准毒株及其雪貂抗血清是针对中国大陆曾经流行的高致病性禽流感H5N1病毒如clade 2,clade 7分支病毒。具体包括：A/Chicken/Viet Nam/NCVD-016/2008(clade 7.1)，A/Turkey/Turkey/1/2005(clade 2.2.1)，A/Bar-nswallow/HongKong/D10-1161/2010(clade 2.3.2.1b)， A/Common magpie/Hong Kong/5052/2007 (clade 2.3.2.1)，A/Hubei/1/2010(clade 2.3.2.1a)，A/Guangxi/1/2009(clade 2.3.2.1b)，A/Guizhou/1/2013 (clade 2.3.4)，A/Guangdong/99170/2014 (clade 2.3.4)。

2结果

2.1高致病性H5N1亚型禽流感病毒分离情况2013年1-9月共采集野鸟和家禽相关环境标本6 364份，共分离到19株H5N1禽流感病毒，全部来源于家禽相关环境，病毒从2013年1-3月间的标本中分离得到，地域分布在西宁活禽市场、乐都活禽市场以及海晏县家禽养殖户。按时间和地域代表性选取其中的7株病毒进行了抗原性分析和二代测序。

表1　青海湖周边家禽相关环境标本分离的H5N1病毒抗原性分析

2.2高致病性H5N1亚型禽流感病毒抗原性分析利用阳性参考血清，对分离的毒株进行抗原性分析。结果显示，7株高致病性H5N1亚型禽流感病毒除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013以外的6株病毒均与clade 2.3.2.1病毒的抗血清有反应，是2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的类似株，不过与2.3.2.1分支中的其他阳性参考血清几乎均呈低反应。A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒与所有参考血清都没有交叉反应，通过随后的基因序列分析提示其属于clade 7.2(见2.3部分)。

2.3高致病性H5N1亚型禽流感病毒HA基因进化树分析选取GenBank公共数据库内H5N1亚型clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2的HA序列43条与本研究分离毒株的序列共同构建进化树。进化树中标注黑色三角符号的病毒也用于抗原分析。HA基因进化划分10个分支(clade 0-9),分支下面有亚支，用四个层级的数字和字母组合。如clade 2.3.2.1之下分为clade 2.3.2.1a,b,c。本研究中的6个病毒(蓝色斜体西文)属于clade 2.3.2.1c亚支，与2009年青海湖地区野鸟中分离的病毒属于同一进化分支，同时与来自中国香港、日本、韩国、越南、保加利亚和蒙古国的病毒在同一分支上。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013(图中以绿色斜体西文表示)在进化上属于clade 7.2分支。近期我国2009年广西和2010年湖北人感染病例分离的H5N1病毒分属于clade 2.3.2.1b和clade 2.3.2.1a，本研究分离的毒株与其均不在同一分支。

黑色三角型为世界卫生组织推荐的疫苗候选株图1　高致病性H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因进化分析Black triangles represent candidate influenza vaccine viruses recommended by WHO Fig.1　Phylogenic analysis of HA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

2.4高致病性H5N1亚型禽流感病毒NA基因进化树分析选取GenBank内HA基因分属于clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2毒株的神经氨酸酶(NA)基因序列40条与7条分离毒株的序列进行比较。NA基因进化没有像HA基因进化那样划分10个分支(clade 0-9)，这种针对HA基因进化的分类方式不适用于NA基因。在NA基因进化上本研究中的7个毒株也明显地分成两个分支，其中6个毒株和clade 2.3.2.1病毒在一起。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013与clade 7.2病毒在一起。

图2　高致病性H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因进化分析Fig.2　Phylogenic analysis of NA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

3讨论

2005年以来在中国大陆能够感染人的高致病性H5N1亚型禽流感病毒包括clade 2.3.4, clade 2.3.2和clade 7病毒株。2005年青海湖地区野鸟感染并引起大量死亡的病毒是clade 2.2 分支的病毒，这类病毒在中国大陆没有造成人感染，但是它却传到了亚洲、欧洲、非洲等国家并且进一步进化。目前在西亚的以色列，约旦河西岸、加沙地带的禽类中流行，引起埃及人间的感染[5]。本研究在青海湖周边野鸟及家禽环境相关标本中仍然未发现此分支病毒。

禽流感监测通常通过病毒的抗原性和基因特性分析来了解病毒的进化和变异情况。而病毒的抗原性分析有赖于参考病毒和参考血清。高致病性禽流感H5N1进化复杂，多个分支病毒出现，使病毒的抗原性发生变化。及时更新参考毒株和参考血清对病毒病原学监测意义重大。本研究中，6株病毒与2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010有最高的血凝抑制效价，提示是clade 2.3.2.1类似株。但是由于没有特异的抗clade 2.3.2.1c血清因此无法进一步细分。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒与所有参考血清都没有交叉反应，无提示作用，只能依赖基因序列分析的结果。

近年来，高致病性禽流感H5病毒在中国的流行呈现三个优势毒株分支，分别为clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2。在各自的分支下面抗原性和基因特性也是多样的。各分支间，高致病性与低致病性病毒间，以及与不同NA亚型之间的重配时有发生。如H5N6病毒在中国导致家禽间暴发并且有致死性人感染病例报道[7]。H5N8病毒由韩国日本传到欧洲和北美。这种H5亚型与不同NA亚型间的重配大多发生在clade 2.3.4的病毒。2012-2014年间在我国免疫过的家禽中分离到了免疫逃逸的重配的高致病性的H5N2病毒。这类病毒分属于clade 7.2和clade 2.3.4与低致病性禽流感H9N2的重配病毒[8]。这种复杂的流行情况给包括中国在内的全球公共卫生带来巨大考验。使疫情应对和防控策略的制定变得更为复杂。为了应对可能由此引起的流感大流行，一系列疫苗储备株被研制成功，随着该类病毒抗原性的变化储备疫苗组分被实时更新。同时为了满足监测的要求，还应及时更新各亚系的代表病毒及其参考血清。

青海湖因其独特的地理位置以及曾经暴发过野鸟的高致病性禽流感疫情使这一地区成为公共卫生关注的区域。加强这一地区野鸟及家禽相关环境的监测可以了解高致病性禽流感毒株的起源、进化、传播以及对可能产生的流感大流行毒株的潜在性加以评估。

4参考文献

[1]WHO/OIE/FAO H5N1 EvolutionWorkingGroup.Continuedevo-lution of highly pathogenic avianinfluenza A (H5N1):updated nomenclature.Influenza OtherRespir Viruses. 2012,6:1-5.doi: 10.1111/j.1750-2659.2011.00298.x. Epub 2011 Oct 29.

[2]http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/Influenza_Summary_IRA_HA_interface_13November_2015.pdf?ua=1

[3]Chen H, Li Y, Li Z. et al. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China. J Virol, 2006,80:5976-5983. doi: 10.1128/JVI.00110-06.

[4]Hu X, Liu D, Wang M, et al. Clade 2.3.2 avian influenza virus (H5N1), Qinghai Lake region, China, 2009-2010. Emerg Infect Dis, 2011,17:560-562. doi: 10.3201/eid1703.100948.

[5]http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/resources/guidance_documents/en/

[6]董婕，杨静，薄洪,等. 青海湖地区禽流感病毒分布情况调查. 疾病监测，2015,30：5613. doi:10.3784/j.issn.1003-9961.2015.07.009.

[7]http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/201502_zoonotic_vaccinevirusupdate.pdf?ua=1

[8]Pan M, Gao R, Lv Q, et al. Human infection with a novel highly pathogenic avian influenza A (H5N6) virus: Virological and clinical findings. J Infect, 2015,pii: S0163-4453(15)00220-0. doi: 10.1016/j.jinf.2015.06.009. [Epub ahead of print]

[9]Ma QX, Jiang WM, Liu S, et al. Subclinical highly pathogenic avian influenza virus infection among vaccinated chickens, China. Emerg Infect Dis, 2014,20:2152-2154. doi: 10.3201/eid2012.140733.

通信作者：舒跃龙， Email：yshu@cnic.org.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.002

基金项目：973课题“重要病毒在不同宿主中的复制机制”(2011CB504704)

(收稿日期：2015-10-02)

Characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake

DongJie,DongLibo,ZhangYe,BoHong,HuangWeijuan,WangDayan,ShuYuelong

KeyLaboratoryforMedicalVirology，ChineseNationalInfluenzaCenter，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，ChinaCorrespondingauthor:ShuYuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

【Abstract】ObjectiveTo understand the antigenic and genetic characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake.MethodsPoultry and wild birds related environments from surrounding areas of Qinghai lake were collected and handled. Viruses were isolated with embryonated chicken eggs. The virus subtyping was performed by real-time RT-PCR. The highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were chosen to conduct next generation sequencing and hemagglutination inhibition (HI) assay.ResultsIn total of 19 H5N1 virus strains were isolated, they were all from poultry related environments and collected in January-March of year 2013. Seven representative highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were sequenced and analyzed for antigenicity. According to phylogenetic analysis of HA gene, 6 viruses were belong to clade 2.3.2.1c except A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 which belongs to clade 7.2. Antigenic analysis showed that 6 viruses were antigenically similar to A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010, while A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 presented low reaction with all reference antisera.ConclusionsThe existence of highly pathogenic avian influenza H5N1viruses in poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake was confirmed. The status of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses with evolution diversity emphasized the necessary of strengthening the avian influenza surveillance in these areas.

【Key words】Highly pathogenic avian influenza; H5N1 subtype; Phylogenetic analysis; Antigenic analysis