Fe3+对VB1与牛血清白蛋白相互作用的影响
2016-08-06郭玉华郁有祝牛永生安阳工学院化学与环境工程学院河南安阳455000
郭玉华,郁有祝,牛永生(安阳工学院化学与环境工程学院,河南安阳455000)
Fe3+对VB1与牛血清白蛋白相互作用的影响
郭玉华,郁有祝,牛永生
(安阳工学院化学与环境工程学院,河南安阳455000)
采用荧光光谱法考察Fe3+对VB1与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影响。试验结果表明,VB1对BSA的内源性荧光有猝灭作用,猝灭类型为动态猝灭,作用力类型为氢键和范德华力。Fe3+的加入并未改变VB1对BSA的猝灭类型和作用力类型,但对其猝灭速率常数(kq)、结合常数(KA)以及结合位点数(n)会有不同程度的影响。同步荧光光谱显示VB1主要与BSA中的色氨酸残基作用,引起其构象或周围环境的改变。
VB1;牛血清白蛋白;Fe3+;荧光光谱
维生素B1(VB1)能够构成辅酶维持体内的正常生理代谢,在临床上主要用于防治脚气病,辅助治疗神经炎、消化不良、全身感染、高热、糖尿病、甲状腺功能亢进等各种疾病[1]。
血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白,在有机体内起着储存、转化、运输等重要生理功能。人体中积累的金属离子会与蛋白结合,影响药物与蛋白的相互作用。因此本文在模拟人体生理pH条件下,选用与人血清白蛋白同源序列高度相似的牛血清白蛋白(BSA),利用荧光光谱法研究Fe3+对VB1与BSA相互作用的影响,为食品及药物在体内的运转、代谢及新药设计开发、从分子水平上阐明药物的作用机理提供参考。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
日立F-7000荧光分光光度计:日立高新技术公司;pHS-3C型精密pH计:上海雷磁仪器厂;CP214电子天平:奥豪斯仪器上海有限公司。
VB1(天津光复精细化工研究所),配成浓度为1.0× 10-3mol/L溶液;牛血清白蛋白(BSA,Roche公司)用pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液(内含0.05 mol/L NaCl)配制成1.0×10-4mol/L溶液;浓度为0.01 mol/L Fe(NO3)3溶液;其余试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
1.2方法
在10 mL比色管中依次加入0.6 mL 1.0×10-4mol/L BSA溶液,1.0 mL pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液及不同体积1.0×10-3mol/LVB1溶液,定容。分别在288K和310K恒温水浴中反应5min。以280nm为激发波长,扫描290nm~450 nm的荧光光谱和再加入0.2 mL Fe3+溶液的荧光光谱。在298 K时测定VB1与BSA相互作用的同步荧光光谱和再加入0.2 mL Fe3+溶液的同步荧光光谱。
2 结果与讨论
2.1VB1,VB1-Fe3+对BSA荧光光谱的影响
VB1,VB1-Fe3+对BSA荧光光谱的影响见图1。
图1 不同反应体系的荧光发射光谱Fig.1 Emission spectra of BSA of different complex systems
由图1可见:以280nm为激发波长,BSA在343nm处有最大荧光发射峰。随VB1及VB1-Fe3+的不断加入,BSA的最大荧光发射峰位置不变,但其荧光发生了有规律的猝灭,说明VB1及VB1-Fe3+与BSA之间发生了相互作用[2]。
2.2荧光猝灭类型和结合常数的确定
荧光猝灭过程常见的有静态猝灭和动态猝灭,猝灭机制可以通过Stern-Volmer方程[3]来研究:
式中:F0和F分别为猝灭剂不存在和存在时体系的荧光强度;Ksv为Stern-Volmer猝灭常数;[Q]为猝灭剂的浓度;Kq为猝灭速率常数;τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命(生物大分子的荧光寿命大约为1× 10-8s[4])。F0/F对[Q]作图求出猝灭常数Ksv和猝灭速率常数Kq,见表1。
表1 VB1,VB1-Fe3与BSA作用的猝灭参数Table 1 Quenching constants of VB1,VB1-Fe3to BSA
药物与BSA作用的结合常数和结合位点数可由式(2)计算[5]:
式中:n为结合位点数;KA为结合常数。
由表1可知,两体系的荧光猝灭常数均随温度升高而增大,说明VB1对BSA的猝灭为动态猝灭[6],Fe3+会使Ksv、Kq增大,增强BSA的荧光猝灭,但不改变荧光猝灭类型。且加入Fe3+后,VB1与BSA之间的结合常数和结合位点数降低,说明Fe3+使VB1与BSA之间的结合作用减弱,Fe3+与VB1间存在竞争作用[7]。竞争作用存在的两个可能原因:一是Fe3+与BSA结合改变了BSA的构象或占据了VB1的结合位点;二是VB1会与Fe3+配位,影响其与BSA的结合。
2.3作用力类型的确定
药物小分子与蛋白质之间的相互作用力主要有氢键、静电作用力、疏水作用和范德华力等。温度变化范围不大时,可认为作用过程的ΔH为一定值。根据热力学方程ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R和ΔG=-RTlnK =ΔH-TΔS,由表1结合常数KA数据,可计算出热力学参数ΔH,ΔS,ΔG。根据Ross[8]理论,由表2知,ΔH<0,ΔS<0,可推断VB1与BSA间的作用力主要为氢键和范德华力,加入Fe3+没有改变两者之间的作用力。同时,ΔH<0说明作用过程是放热过程,温度的升高不利于反应向正反应方向进行,所以结合常数和结合位点数随温度升高而减小,与表1中数据一致。
表2 VB1,VB1-Fe3+与BSA作用的热力学参数Table 2 Thermodynamic constants of VB1,VB1-Fe3+to BSA
2.4同步荧光光谱
蛋白质的荧光主要来自于色氨酸、酪氨酸,所以通过对色氨酸、酪氨酸同步荧光的测定,可以探讨色氨酸或酪氨酸的构象变化或周围环境是否变化。Δλ= 15 nm和Δλ=60 nm时分别显示的是酪氨酸和色氨酸残基的荧光特征[9]。
有无Fe3+时,VB1与BSA作用的同步荧光光谱图相似,见图2。
图2 反应体系的同步荧光光谱Fig.2 Synchronous fluorescene spectra of complex system
由图2可知,随VB1浓度增大,酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均逐渐降低,说明有无Fe3+时,VB1与酪氨酸和色氨酸残基均能发生作用,使其附近微环境改变[10]。但Δλ=60 nm条件下,荧光猝灭程度更明显,推断VB1与BSA结合的位置主要在色氨酸残基[11]。
3 结论
利用荧光光谱法考察了Fe3+对VB1与BSA相互作用的影响。结果发现,Fe3+的存在并未改变VB1对BSA的猝灭类型,但使猝灭常数增大,结合常数和结合位点数减小。VB1与BSA的作用过程为自发过程,主要以氢键和范德华力为主,Fe3+的加入没有改变其作用力类型。同步荧光表明,VB1主要与色氨酸残基结合。总之,Fe3+影响VB1与BSA的结合,表现为与VB1存在竞争作用。可见,选择合适的金属离子,可以适当的改善VB1与BSA的作用,使其更好发挥功效,可为食品和药物的设计与开发提供参考。
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Effect of Fe3+on the Interaction of VB1and Bovine Serum Albumin
GUO Yu-hua,YU You-zhu,NIU Yong-sheng
(College of Chemistry and Environmental Engineering,Anyang Institute of Technology,Anyang 455000,Henan,China)
The interactionofVB1and bovine serum albumin(BSA)was studied in the presence of Fe3+by fluorescence spectroscopy.The results indicated that VB1could quench the intrinsic fluorescence of BSA,the quenching mechanism was static quenching and the main binding force was hydrogen bond and Vander Waals.The fluorescence quenching mechanism and the main binding force were not changed in the presence of Fe3+,but the quenching rate constant(k)q,the binding constants(KA)and the binding sites(n)were changed in different degrees.Synchronous spectra showedthatVB1binded to tryptophan residue and changed its microenvironment.
VB1;bovine serum albumin;Fe3+;fluorescence spectroscopy
10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.012
安阳工学院青年科研基金项目(201318)
郭玉华(1979—),女(汉),副教授,硕士,主要从事药物分析研究。
2015-04-10