广东夏大豆新品种（系）分子身份证的构建

唐玉娟，宋恩亮，王梓钰，马启彬，年 海

（1.华南农业大学农学院/国家大豆改良中心广东分中心，广东 广州 510642；2.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001；3.吉林省农科院大豆研究所，吉林 长春 130033）

广东夏大豆新品种（系）分子身份证的构建

唐玉娟1，2，宋恩亮1，2，王梓钰1，3，马启彬1，年 海1

（1.华南农业大学农学院/国家大豆改良中心广东分中心，广东 广州 510642；2.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001；3.吉林省农科院大豆研究所，吉林 长春 130033）

建立快速简便鉴定广东夏大豆种质资源的方法。对大豆20个连锁群上的159对SSR引物进行筛选，其中48对引物扩增清晰、稳定，用其检测34份广东夏大豆材料，将数字化后的等位变异片段用资源特征分析软件ID Analysis 1.0进行分析。结果表明，48对多态性引物平均等位变异数为3.88，平均基因多样性指数为0.50，平均引物多态性信息含量（PIC）为0.45，可用于区分广东夏大豆资源。仅需5对引物（Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292）可将全部34份种质区分开，成功构建了一套广东夏大豆种质的分子身份证。

夏大豆；分子身份证；SSR

唐玉娟，宋恩亮，王梓钰，等.广东夏大豆新品种（系）分子身份证的构建［J］.广东农业科学，2016，43（5）：37-41.

大豆起源于中国，是重要的粮食及油料作物，在农业生产和国民经济中占有重要地位［1-2］。目前，我国大豆育种过程中存在新种质匮乏及骨干亲本反复利用的情况，导致许多大豆育成品种遗传基础趋于狭窄，遗传差异变小，传统的形态学鉴定方法越来越不适应目前的育种工作［3-4］。以分子标记为基础的DNA指纹技术具有快速、准确、简单、不受环境条件影响的优点，标准的DNA指纹图谱库一旦建立，就可以迅速地应用于品种鉴定［5-6］。研究中常见的分子标记包括AFLP、RFLP、SSR等。SSR标记因其数量丰富、多态性高、表现稳定、共显性遗传和操作简便等优点，被广泛应用于植物新品种的鉴定与保护［7-8］。分子身份证（molecular ID）是国内学者在DNA指纹图谱的基础上提出的一个概念，是鉴定种质资源的一种新方法。这种方法利用资源特征分析软件，对数字化编码赋值的等位变异进行分析，以最少的引物数对资源进行区分，得到一组一定引物顺序下的编码组合，该编码组合即代表了种质间的差异，具有易于统计分析和长期保存的优点［9］。

高运来等首次利用自主开发的资源特征分析软件对43对SSR引物在83份黑龙江大豆品种中的变异进行检测，9对引物即可将全部材料区分开，建立了黑龙江部分大豆品种的分子身份证［10］。李伟忠等［11］选取优良玉米自交系257份，用64对引物对其进行扩增，构建了一套由10对引物组成的分子身份证。王黎明等［12］利用41对多态性引物扩增来自6个国家的甜高粱种质资源，成功构建了10对引物组成的142份品种的分子身份证。马琳等［13］通过分析33对SSR标记在130份常见的甘蓝型油菜品种中的等位变异，获得了由7对引物组成的指纹图谱，并在此基础上构建了分子身份证。分子身份证的构建不仅可以准确区别和快速鉴定种质资源，同时也是品种真伪鉴定和知识产权保护的重要手段［14］。分子身份证的构建技术已经成熟，但目前尚未有针对广东地区大豆种质资源的相关研究报道。从覆盖大豆20个连锁群上的SSR引物中筛选得到扩增清晰、稳定的引物，通过分析以最少的引物组合将34份广东夏大豆材料进行区分。本研究以34份广东夏大豆新品种（系）为试材，利用SSR分子标记建立大豆分子身份证体系，以期为广东夏大豆新品种（系）的分子鉴定提供快速简便的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为34份广东夏大豆品种（系），包括华南农业大学农学院国家大豆改良中心广东分中心近年来育成品种8份（华夏1号、华夏2号、华夏3号、华夏4号、华夏5号、华夏6号、华夏9号、桂夏豆2号）、育种过程中筛选的优良品系19份（V5、V6、V7、V10、V13、V14、V15、V16、V22、V23、V26、V27、V31、V32、V33、V35、V38、V46、V47）、巴西引进品系3份（巴西3号、巴西8号、巴西13号）和广东地区常用农家种4份（连南黑脐、连南浅色脐、龙川青豆、英德黑豆）。

1.2 叶片总DNA提取与SSR标记

叶片总DNA提取方法为SDS法，PCR反应体系与扩增条件参考曾巧英［15］方法并略加改进，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。从均匀分布于大豆公共遗传图谱的20个连锁群上的159对引物中，筛选保留条带清晰、差异明显的48对SSR引物用于分析。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 数据统计分析

引物等位位点数目、基因多样性指数以及多态性信息含量（PIC）等一般统计量由PowerMarker V3.25软件分析获得。利用分析软件Quantity One对比实验中所加入的Marker的条带大小，读取48对引物在34份材料中的扩增片段大小，以等位变异的大小为依据，对每对引物在34份材料中的扩增片段进行分型，分子量由大到小，依次为1、2、3、4 …… N统计数据（图1）。基因片段丢失记为0，实验操作造成缺失记为-1，杂合带型记为-2。利用东北农业大学开发的资源特征分析软件ID Analysis 1.0（2007SR11870a）构建广东夏大豆资源分子ID。

图1 Satt277等位基因特征

2 结果与分析

2.1 标记等位基因信息分析

用159对引物对34份品种（系）进行扩增，保留其中多态性高且差异明显的48对引物。利用PowerMarker V3.25进行统计（表1），每对引物检测到的等位位点数分布范围为2～8个，共检测到多态性片段186个，平均为3.88个；基因多样性指数分布范围为0.06～0.82，平均为0.50；引物多态性信息含量（PIC）变幅为0.06～0.80，平均为0.45。所用引物平均等位位点数较多，基因多样性指数较高，可用于区分不同大豆品种（系），构建广东夏大豆新品种（系）的分子身份证。

2.2 广东夏大豆分子身份证的构建

分子身份证包括两类，一类是以特异等位位点进行区分，利用ID Analysis 1.0 对所筛选出的48对引物在34份种质中的等位变异进行分析，软件剔除了缺失过多的3对引物（Sat_139、Sct_196、Satt462），保留的45对引物在34份大豆材料中共有32个特异等位位点（表2）。通过这些特异等位位点可以直接鉴定对应的材料，如Satt277在材料V10中有特异条带1，表示在Satt277各带型中，有且只有V10表现为第1种带型，可以据此为依据鉴定V10。以此类推，其他各特异位点均可用来鉴定对应种质。

特异等位位点可通过单一引物直接鉴定材料，但一般只存在于少量种质中，更多的材料只能采用第二类方法，即用2对或2对以上的引物组合的差异位点来区分，当2对引物不能完全区分所有材料时，就增加引物数直到所有材料可以区分开。利用ID Analysis 1.0对所筛选出的48对引物在34份材料中的带型进行分析，软件在剔除了缺失过多的3对引物的基础上，进一步剔除了与其他引物相似系数过高的Sat_224、Sat_287等21对引物，最终保留24对引物用于筛选引物组合，区分夏大豆种质。结果表明，最少利用Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292共5对引物就可以将全部34份种质区分开（表3），以V5为例，其ID 为26425，它表示这5对引物扩增V5后得到的等位基因按照片段大小分别位于Sat_267的第2位、Sat_235的第6位、Satt277的第4位、Sat_351的第2位 和Sat_292的第5位，V5是34份材料中唯一具有这一等位位点组合的种质，所以由这些引物等位基因所组成的字符串就可以代表V5的分子ID。

表1 引物扩增等位位点数目、基因多样性指数及多态信息含量

3 结论与讨论

从覆盖大豆20个连锁群上的159对SSR引物中筛选出48对扩增清晰、稳定的引物，多态性引物平均等位变异数为3.88，平均基因多样性指数为0.50，平均引物多态性信息含量（PIC）为0.45，可用于区分广东夏大豆资源，利用其中的Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292共5对引物就可以将全部34份广东夏大豆品种（系）区分开，构建了一套广东夏大豆分子身份证。

高运来等［10］在构建黑龙江部分大豆分子身份证时发现，遗传背景差异较大的品种分子身份证相差较大，而亲缘关系较近的品种具有相似的分子身份证。从本研究的结果中可看到，华夏1号和华夏4号的分子身份证非常相近，分别为25422和25432，仅在第4对引物即Sat_351中存在差别，分析这两个品种的来源，我们发现，华夏1号来源为桂早1号×巴西3号，华夏4号来源为桂早1 号×巴西8号，两品种具有相同的母本，因此在Sat_351中的差异片段应来源于父本巴西3号和巴西8号，从结果中可以看到两种质在Sat_351中的带型分别为2和3，与各自子代的带型一致，进一步证明了此方法鉴别种质的准确性。同时，在育种过程中也可以通过分子身份证来推断某些来源不明确的品系可能的亲本。

构建分子身份证要求引物具有一定的等位基因数，但并不是简单的将等位基因数最多的引物筛选出来，而是要兼顾多样性指数，将缺失过多和相似系数过高的引物剔除，用尽可能少的引物将全部材料区分开［16］。本研究中获得的引物组合并非是能够鉴别34份夏大豆种质的唯一引物组合，选取的48 对引物中应存在多个可将材料区分开的组合，本研究只是将其中最优的一组筛选出来。

表2 含有特异带型的材料及其对应位点

表3 34份广东夏大豆品种（系）的分子身份证

［1］王锦辉，王丹华，蒋洪蔚，等.利用野生大豆回交导入系定位油分含量QTL［J］.中国油料作物学报，2015（3）：277-284.

［2］赵团结，盖钧镒.栽培大豆起源与演化研究进展［J］.中国农业科学，2004，37（7）：954-962.

［3］邱丽娟，王昌陵，周国安，等.大豆分子育种研究进展［J］.中国农业科学，2007，40（11）：2418-2436.

［4］赵团结，盖钧镒，李海旺，等.超高产大豆育种研究的进展与讨论［J］.中国农业科学，2006，39（1）：29-37.

［5］程本义，施勇峰，沈伟峰，等.水稻品种DNA指纹检测技术体系及其应用［J］.杂交水稻，2008，28 （1）：54-59.

［6］匡猛，杨伟华，许红霞，等.中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析［J］.中国农业科学，2011，44（1）：20-27.

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［11］李伟忠，许崇香，安英辉，等.257份玉米自交系分子ID的构建［J］.玉米科学，2013（2）：24-30.

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［13］马琳，刘海珍，陆徐忠，等.130份甘蓝型油菜种质分子身份证的构建［J］.中国油料作物学报，2013 （3）：231-239.

［14］刘新龙，马丽，陈学宽，等.云南甘蔗自育品种DNA指纹身份证构建［J］.作物学报，2010，36（2）：202-210.

［15］曾巧英.南方野生大豆耐铝性关联分析及对铝响应的miRNA［D］.广州：华南农业大学，2012.

［16］杜晶晶.基于SSR标记的葡萄遗传多样性分析及分子身份证构建［D］.海口：海南大学，2013： 59.

（责任编辑 杨贤智）

Establishment of molecular ID of summer soybean varieties （lines） in Guangdong

TANG Yu-juan1，2，SONG En-liang1，2，WANG Zi-yu1，3，MA Qi-bin1，NIAN Hai1
（1.College of Agriculture，South China Agricultural University/Guangdong Subcenter of National Center for Soybean Improvement，Guangzhou 510642，China；2.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，China；3.Soybean Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

To establish a fast and simple method for identifying Guangdong summer soybean varieties （lines），48 primers showing polymorphic bands were screened from 159 SSR primers covering 20 linkage groups of soybean chromosome，and be used to detected 34 Guangdong summer soybean varieties （lines）.The data number ranked from fragment size of allele variation were analyzed by the software ID Analysis 1.0 .The average number of alleles by each primer was 3.88，and the average of gene diversity index and polymorphism information content （PIC） of the 48 SSR loci was 0.50 and 0.45，respectively.These primers could be used to identify the Guangdong summer soybean germplasm.Only using five primers （Sat_267，Sat_235，Satt277，Sat_351 and Sat_292） could identify all 34 materials.A set of molecular ID was established for Guangdong summer soybean varieties （lines）.

summer soybean；molecular ID；SSR

S565.1

A

1004-874X（2016）05-0037-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.008

2016-01-08