重瓣长寿花组织培养再生体系的建立1)

范诸平　王立雪　杨东　曹德憧　于义　张彦妮

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



重瓣长寿花组织培养再生体系的建立1)

范诸平王立雪杨东曹德憧于义张彦妮

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

摘要以重瓣长寿花的茎段和叶片为外植体，利用单因子和交叉试验设计，探究了不同激素组合对叶片和茎段愈伤组织的诱导、分化及生根的影响，以及不同栽培基质对移栽成活率的影响。结果表明：适合愈伤组织诱导的外植体是茎段，最佳愈伤组织诱导培养基是MS+6-BA0.10 mg·L-1+2,4-D1.00 mg·L-1,以茎段为外植体的愈伤组织诱导率为100.000%；最佳的愈伤组织分化培养基是MS+6-BA1.00 mg·L-1,增殖系数达19.920；最佳的生根培养基是1/2MS+IBA0.50 mg·L-1,生根率为100.000%，根长3.87 cm；最佳的栽培基质是V(园土)∶V(蛭石)=2∶1，此时移栽成活率为95.710%。

关键词重瓣长寿花；组织培养；愈伤组织；再生体系

长寿花(Kalanchoe blossfeldiana)是景天科伽蓝菜属的一种多年生草本植物，具有圆锥状聚伞花序，小花高脚碟状，花色有橙红、桃红、黄色等[1]，自12月份至翌年4月份开花，花期长达4个月，观赏价值极高，是一种重要的室内盆栽花卉。近年来，国内外学者主要进行了长寿花抑菌特性[2]、杂交亲和性[3]、基因表达与调控[4-7]、无土栽培[8-11]等方面的研究。长寿花一般采用扦插的方法进行繁殖[12]，速度较慢且增殖系数小，一块叶片或一个茎段仅能发育成一个植株，且繁殖方法易受季节影响，远不能满足生产上的需求[13]。而利用组织培养的繁殖方法不仅不受天气、季节的影响[14]，且繁殖速度快、增殖系数高，可以为进一步的科学研究和工厂化生产奠定基础。长寿花的很多器官、组织都可以作为外植体进行愈伤组织的诱导、不定芽分化和植株再生，目前的研究主要集中于叶片[12，14-18]、叶柄[19]、花序[20]、茎段[20]、茎尖[21]等。品种及外植体类型对离体器官的再生成苗有很大影响，不同基因型的植株有不同的最适宜的培养基[22]。

重瓣长寿花是长寿花近年来推出的栽培新品种[20]。该品种与其原种长寿花相比，由于花朵的重瓣性，花色更加艳丽、观赏价值更高，因而其市场价格高出同规格的长寿花近一倍。重瓣长寿花自然花期长，是一种重要的年宵花卉，又因其名字寓意健康长寿，因而具有广阔的市场发展前景[18]。目前，国内有关长寿花离体培养的报道较多，而对于重瓣长寿花的组织培养报道仅有两例，分别以花序[20]和叶片[23]为外植体,建立了重瓣长寿花的组培再生体系，尚未见以茎段为外植体诱导愈伤组织的报道。

文中通过不同的培养基和栽培基质筛选比较，分别以重瓣长寿花的叶片和茎段作为外植体，从愈伤组织诱导及分化、不定芽生根到炼苗移栽，总结了一套增殖系数高达19.920的完整的组培繁殖方法，可以满足大批量现代化温室生产的需求，并能在质量上达到更高标准，同时为重瓣长寿花进一步的遗传改良奠定基础。

1材料与方法

试验材料重瓣长寿花购自哈尔滨市花卉市场，于2015年3月6日选取生长健壮、无病虫害的叶片、茎段为外植体。将剪好的外植体盛装于小烧杯中，先用洗衣粉水冲洗10 min，再用流水冲洗10 min。在超净工作台中，先用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗1遍，再用1.00%的NaClO浸泡15 min，无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干材料表面的水分，将外植体剪成约1 cm2的叶片和1.50 cm左右的茎段[24]。

愈伤组织的诱导:通过查阅文献，选取了4种培养基(表1中1～4号)作为预试验培养基。具体方法为将切割好的叶片和茎段外植体接种到由6-BA和NAA组合的愈伤组织诱导培养基上，置于温度25 ℃，光照强度3 000 lx，光照时间16 h·d-1的条件下进行培养。每处理50个外植体，重复3次，15 d后统计愈伤组织诱导率并记录生长状况。根据预试验结果，以愈伤组织诱导率高且植株生长健壮的激素组合为参考质量浓度，又设置了一些激素质量浓度组合(表1)，进一步探究最适合叶片和茎段愈伤组织诱导的激素质量浓度组合。

不定芽的分化：挑选生长健壮、质地疏松的愈伤组织接种到8种分化培养基(表2)上，每处理50个外植体，重复3次，30 d后统计愈伤组织的分化率并记录生长状况。

不定芽生根：待愈伤组织再分化形成的不定芽长到2 cm左右时，转入由1/2MS和NAA、IBA组成的8种生根培养基中，30 d后观察生根情况并记录。

炼苗及移栽：待根生长至2～3 cm时，将封口膜半打开状态放置1 d，再完全去掉封口膜放置1 d，在自来水下小心冲去组培苗根部的培养基，移栽至由V(园土)∶V(蛭石)=2∶1、V(园土)∶V(珍珠岩)=2∶1、V(园土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=2∶1∶1栽培基质中，在温室中栽培，及时浇水，去除杂草，30 d后统计移栽成活率。

利用Microsoft excel软件统计分析愈伤组织诱导率、增殖系数、生根率、生根系数和移栽成活率，利用SPSS 19.0统计分析软件进行方差分析，利用邓肯氏多重比较(Duncan’s multiple-range test)检验其显著性，P>0.05为变化不显著，P<0.05为变化显著。

2结果与分析

2.1不同质量浓度6-BA、NAA、2,4-D组合对愈伤组织诱导的影响

在6-BA与NAA共同作用下，10 d左右叶片和茎段外植体均产生少量较为紧实的深绿色的愈伤组织(图1A)，茎段外植体产生的愈伤组织量明显大于叶片。以叶片为外植体，愈伤组织诱导率最高的激素组合为3号培养基，愈伤组织诱导率为96.670%，叶片在接种一周后边缘处膨大，15 d时产生深绿色的愈伤组织，但较为紧实。以茎段为外植体，愈伤组织诱导率最高的激素组合为7号培养基，愈伤组织诱导率为100.000%，比以叶片为外植体的愈伤组织诱导率高3.330%(表1)。茎段下部在接种一周后开始膨大并产生少量愈伤组织，继而不断膨大，自茎段基部产生大量愈伤组织，绿色颗粒状且较为蓬松。

表1　不同激素组合对重瓣长寿花外植体愈伤组织诱导的影响

注：表中部分数据为平均值±标准差；同列不同小写字母代表0.05水平上存在显著差异。

A.深绿色致密状愈伤组织；B.黄绿色蓬松状愈伤组织；C.茎段诱导形成的愈伤组织分化形成的不定芽；D.叶片诱导形成的愈伤组织形成的不定芽；E.生根培养；F.生成的大量绒毛状须根；G.以V(园土)∶V(蛭石)=2∶1为栽培基质移栽形成的小苗；H.以V(园土)∶V(珍珠岩)=2∶1为栽培基质移栽形成的小苗；I.以V(园土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=2∶1∶1为栽培基质移栽形成的小苗。

图1重瓣长寿花叶片茎段愈伤组织诱导、不定芽分化及植株移栽

在2,4-D与6-BA的共同作用下，7 d左右外植体即可产生大量黄绿色颗粒状的愈伤组织，透明蓬松，与胚性愈伤组织的形态特征基本相符[25](图1B)。以叶片为外植体，愈伤组织诱导率最高的激素组合为8号培养基，愈伤组织诱导率高达97.330%(表1)，叶片在接种一周后边缘膨大，15 d时产生黄绿色透明疏松颗粒状的愈伤组织。以茎段为外植体，愈伤组织诱导率最高的激素组合为10号培养基，愈伤组织诱导率高达100.000%，茎段在接种10 d后下部膨大，20 d左右时产生大量浅绿色的愈伤组织，愈伤组织质地疏松，呈颗粒状，具备胚性愈伤组织的基本特征。

当3种激素共同作用时，愈伤组织形态与所占比例高的激素的诱导形态相一致，诱导率较两种激素组合时均有所下降。

由表1可以看出，3号、7号、8号、10号为诱导率较高的4种培养基，但是3号、7号以6-BA、NAA为激素的培养基所诱导的愈伤组织量少且颜色深绿，不具备胚性愈伤组织的基本特征，8号以2,4-D与6-BA为激素的培养基，其叶片外植体愈伤诱导率小于10号以茎段为外植体的愈伤组织诱导率。因此，最适合愈伤组织诱导的外植体是茎段，最适宜的诱导培养基是10号培养基，即MS+6-BA0.10 mg·L-1+2,4-D1.00 mg·L-1。

2.2不同质量浓度6-BA、NAA、2,4-D组合对愈伤组织分化的影响

在诱导愈伤组织再分化时，本试验共设有MS和6-BA、NAA一种或两种激素搭配的共8种组合(表2)。将叶片和茎段诱导产生的愈伤组织切割成小块后接种在8种培养基上，10 d左右愈伤组织上即有不定芽长出，30 d后统计增殖率。在6-BA质量浓度为1.00 mg·L-1时增殖系数最高，达19.920,不定芽颜色深绿、健壮且密集(图1C、图1D)。当NAA质量浓度增高和降低都会使增殖系数降低，不定芽叶质变软或呈水渍状。因此，最适合愈伤组织分化的培养基是MS+6-BA1.00 mg·L-1。

2.3不同生根培养基对不定芽生根的影响

以1/2MS为基本培养基，添加不同质量浓度NAA和IBA，试验结果证明(表3)，生根培养14 d时，基部均有不同数量的不定根生成。随着添加NAA和IBA质量浓度的增加，重瓣长寿花的生根系数均是先增加后减少。在NAA质量浓度为0.20 mg·L-1时，生根率为100.000%，生根系数达到12.330，根长1.410 cm，根系生长状况良好，黑色须根多而粗壮，茎基部密生白色绒毛状须根(图1E、图1F)。随NAA质量浓度的变化，当NAA质量浓度大于或小于0.20 mg·L-1时，根多为绒毛状根，无粗壮根，且铺满培养基表面不能深入培养基。在IBA质量浓度为0.50 mg·L-1时，生根率为100.000%，生根系数达到最高，为14.360，根长3.870 cm，主根黑色粗壮，且在茎基处生成新的小植株。该种培养基与NAA为0.20 mg·L-1的培养基相比，生根率均为100.000%，但该种培养基的生根系数和根长大于前者，因此是最适合生根的培养基。

当同时添加两种激素时，生根量少，根短而细弱。综上，最适合生根的培养基是7号培养基，即1/2MS+IBA0.50 mg·L-1。

表2　不同激素组合对重瓣长寿花愈伤组织分化的影响

注：表中部分数据为平均值±标准差；同列不同小写字母代表0.05水平上存在显著差异。

表3　不同激素组合对重瓣长寿花不定芽生根的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母代表0.05水平上存在显著差异。

2.4不同栽培基质对再生苗移栽的影响

从表4可以看出，组培苗在V(园土)∶V(蛭石)=2∶1的基质中成活率最高(95.710%)，且植株生长速度最快，茎粗壮，叶片大而深绿(图1G)。在添加珍珠岩的栽培基质中，组培苗的移栽成活率降低，且移栽后生长状况劣于前者，株高和叶片面积均低于前者(图1H、图1I)。其中，V(园土)∶V(珍珠岩)=2∶1的栽培基质成活率最低，仅为87.140%。因此，最适合重瓣长寿花组培苗生长的栽培基质为V(园土)∶V(蛭石)=2∶1。

表4　不同栽培基质对移栽成活率的影响

注：表中部分数据为平均值±标准差；同列不同小写字母代表0.05水平上存在显著差异。

3结论与讨论

不同的外植体愈伤组织诱导难易程度不同，对重瓣长寿花来说，茎段的愈伤组织诱导率显著高于叶片，并在培养基质量浓度为2,4-D1.00 mg·L-1+6-BA0.10 mg·L-1时达到最高，为100.000%。这与树莓[26]、鞍杂杨[27]、食用玫瑰[28]、铁皮石斛[29]、红网纹草[30]等研究结果一致。在试验过程中发现，茎段产生的愈伤组织在不定芽分化、生根及组培苗移栽阶段的表现均优于叶片。原因可能是不同外植体所含的内源激素种类、浓度存在差异[31]，外植体所处的生理状态、生长发育阶段不同[32-33]。利用茎段作为外植体，愈伤组织诱导率高达100.000%，这种方法优于利用叶片诱导愈伤组织的方法，且重瓣长寿花分枝较多，茎段取材较为丰富。本试验没有进一步研究茎尖的再生体系建立效果是否高于茎段，需在今后的试验中进一步探索。

植物生长调节剂在组织培养的过程中有着重要的作用[34]。本试验中发现，将6-BA与2,4-D组合在一起，诱导出的愈伤组织为半透明浅绿色颗粒状。而将6-BA与NAA组合在一起，诱导出的愈伤组织为深绿色，质地较为紧实，在后期的分化以及生根、移栽等方面均劣于前者。这与Mucciarelli et al.[35]、 Linacero et al.[36]的研究结果吻合，说明2,4-D对于重瓣长寿花愈伤组织诱导具有重要作用，且适宜质量浓度的2,4-D有利于胚性愈伤组织的形成。

段鹏慧等[23]的研究表明，利用叶片诱导生成的愈伤组织，在1/2MS+6-BA1.00 mg·L-1+NAA0.10 mg·L-1的培养基上，增殖系数可达12.2。本试验利用茎段诱导生成的愈伤组织，在MS+6-BA1.00 mg·L-1的培养基上，增殖系数可达19.920，显著高于以叶片为外植体的增殖系数。原因可能是不同的外植体对不同激素质量浓度组合的反应不同，茎段较之叶片为中度成熟器官，而中度成熟器官在分化率上高于幼嫩器官[37]。另外，无论MS与NAA的质量浓度如何，关艳清[16]、崔广荣[21]等的试验结果也表明，最适宜的6-BA质量浓度是1.00 mg·L-1，说明在愈伤组织分化过程中，6-BA的质量浓度选择至关重要，原因是6-BA作为一种重要的细胞分裂素，对于细胞的分裂分化以及器官的形成有着关键作用。

不同的栽培基质对移栽成活率有影响。试验结果表明，在V(园土)∶V(蛭石)=2∶1的栽培基质中，移栽苗的生长状况最佳，移栽成活率最高，高达95.710%。而在栽培基质中添加珍珠岩后，由此而组成的两种培养基的移栽成活率均有所下降，其中V(园土)∶V(珍珠岩)=2∶1的培养基移栽成活率为87.140%，下降8.570%；由V(园土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=2∶1∶1的栽培基质移栽成活率为90.000%，下降5.710%。原因可能是园土和蛭石构成的栽培基质质地较紧实，持水力大，能够贮存更多的水分[38]，而重瓣长寿花原产非洲马达加斯加，生长过程中也需要较多水分，因而由园土和蛭石构成的栽培基质更能够保证重瓣长寿花移栽初期充足的水分供应。或者是园土与蛭石构成的基质具有适合重瓣长寿花发育的养分供应能力和酸碱度[39-40]。

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第一作者简介：范诸平，女，1993年8月生，东北林业大学园林学院，本科生。E-mail:2663168876@qq.com。 通信作者：张彦妮，东北林业大学园林学院，副教授。E-mail:ynzhang808@126.com。

收稿日期：2016年1月30日。

分类号S682.36;Q943.1

Establishing the Regeneration System for Double-flowered Kalanchoe blossfeldiana//

Fan Zhuping, Wang Lixue, Yang Dong, Cao Dechong, Yu Yi, Zhang Yanni(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：54-58.

We established an in vitro culture system of double-flowered Kalanchoe blossfeldiana using leaves and stem segments by single and cross-over designs, and studied the effects of leaves and stems callus induction, differentiation, rooting with different hormone combination, and the effects of survival rate with different cultivating media.The stem segments were the most appropriate among all kinds of explants.The optimal medium for callus induction was MS medium supplemented with 0.10 mg·L-16-BA, 1.00 mg·L-12,4-D in which the stems had the highest induction rate of 100.000%.The best medium for callus differentiation was MS medium supplemented with 1.00 mg·L-16-BA, and the multiplication coefficient reached 19.920.The most suitable rooting medium was 1/2MS medium containing 0.50 mg·L-1IBA.The rooting rate was 100.000% and the root length was 3.87 cm.The best cultivation matrix volume proportion was 2∶1 of garden soil and vermiculite with the transplanting survival rate of 95.710%.

KeywordsDouble-flowered Kalanchoe blossfeldiana; Tissue culture; Callus; Regeneration system

1)国家大学生创新创业训练计划项目(201510225064)、黑龙江省留学归国科学基金项目(LC201410)。

责任编辑：任俐。