苯甲酸雌二醇对绝经后骨质疏松模型大鼠子宫内膜及子宫肥大细胞数量的影响

祁珊珊 王永吉

陕西理工学院维生素D生理与应用研究所，陕西 汉中 723000

妇女绝经后因卵巢功能下降、雌激素水平骤降，体内骨转换率显著加快，骨吸收的速度超过骨形成的速度，导致骨量丢失、骨密度下降、骨骼脆性增加引起的骨质疏松症称为绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。去卵巢大鼠构建的骨质疏松模型是研究雌激素缺失引起的绝经后骨质疏松症的最适模型，该模型已广泛应用于雌激素缺失诱导的骨质疏松症的研究中[2]。我们前期在对去卵巢骨质疏松大鼠的研究中发现，大鼠卵巢去除后不仅会引起骨质丢失，还会引起子宫萎缩及子宫组织结构的改变[3]，我们推测子宫形态的改变可能是由于雌激素缺失所致，给药补充外源雌激素是否会使子宫复原？本研究将用组织形态计量学方法对这一问题进行回答。

此外，肥大细胞是天然免疫的效应细胞之一，在天然免疫中发挥重要作用，是机体抗感染免疫的一线细胞，它能分泌40 余种生物活性物质或细胞因子(如组胺、蛋白酶、血管内皮生长因子等)[4]。研究表明子宫肥大细胞数量在发情周期中发生波动，这种波动可能与雌激素的分泌活动有关。现已证实人、仓鼠、小鼠、山羊子宫MC的数量分布随动情周期的改变而呈周期性变化[5,6]，而雌激素也随生殖周期的改变而改变。这提示了雌激素水平的改变可能是导致子宫中肥大细胞数量改变的直接原因。然而这些研究仅集中于动情周期，卵巢是机体产生雌激素的重要器官，卵巢切除后大鼠子宫肥大细胞是否会受影响，补充外源雌激素是否会对子宫肥大细胞产生影响？这方面的研究目前还没有相关的文献报道，本研究将利用组织学和组织化学的方法对上述问题进行回答。肥大细胞在数量与分布上的变化可能与子宫局部的免疫调节功能有关。

1 材料和方法

1.1 实验动物

40只3月龄健康雌性SD大鼠(由西安交通大学实验动物中心提供，为国家A级实验动物，许可证号：SCXK2012-003)，体质量194～230 g，分笼饲养，自由饮水，适应性饲养1 w后随机分为手术组(OVX组)和假手术组(Sham组)，每组各半。

1.2 卵巢去除手术

手术方法见参考文献[7]。

1.3 给药及分组

大鼠卵巢去除手术后3个月，将卵巢摘除组(OVX)和假手术组(Sham)大鼠重新分组，分别是OVX组、OVX+苯甲酸雌二醇组、Sham组，每组6只，OVX+苯甲酸雌二醇组腹腔注射苯甲酸雌二醇20 μg/(kg·d)，每隔1天给药1次，连续给药28 d，Sham组和OVX组腹腔注射花生油作对照。具体分组及给药方法见表1。

1.4 组织样品采集

给药28 d后，称取大鼠体重，CO2麻醉后进行眼眶静脉采血，采血结束颈椎脱臼处死大鼠。打开腹腔，取出子宫固定于3.7%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h。

1.5 子宫组织学及肥大细胞形态观察

子宫组织样品进行固定、脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)，分别进行HE染色和改良甲苯胺蓝染色，95%酒精分化，脱水，透明，封片，光学显微镜观察子宫组织形态和子宫肥大细胞的分布。

1.6 肥大细胞的计数

每个子宫样本每隔 5张连续切片计数一张，共查 5张， 每张切片为一完整的子宫横断面，低倍镜下(10×10)计数子宫横断面所有肥大细胞，并求 5张切片肥大细胞的均数，据此求得各组肥大细胞计数值。

1.7 统计学处理

利用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素组间方差分析和比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05时差异有统计学意义。

表1 各组动物的处理Table 1 Treatment of animals in each group

2 结果

2.1 苯甲酸雌二醇对去卵巢骨质疏松模型大鼠子宫内膜形态的影响

组织学观察显示假手术组(Sham组)大鼠子宫壁结构正常，上皮为单层柱状上皮，固有层分布有子宫腺，肌层为多层平滑肌，肌纤维排列紧密。去卵巢模型组(OVX组)大鼠子宫腔径显著变小，子宫黏膜上皮厚度较假手术组明显减小，子宫内膜和肌层明显变薄，固有层子宫腺减少，腺腔狭窄，肌纤维细小。OVX大鼠给药苯甲酸雌二醇28d后，子宫腔径增大，黏膜上皮的厚度也明显增大，组织形态计量数据见表2。

表2 大鼠子宫腔径、肌层厚度、子宫黏膜上皮厚度的形态计量结果Table 2 The histomorphometry results of uterine cavity diameter, uterine muscle thickness, and uterine epithelium thickness in rats

2.2 子宫肥大细胞的分布及形态

图1 肥大细胞在大鼠子宫中的分布及形态A. 子宫黏膜下层的肥大细胞 甲苯胺蓝 200×；B.子宫黏膜下层血管旁的肥大细胞 甲苯胺蓝 200×； C. 子宫腺体旁的肥大细胞 甲苯胺蓝 400×； D. 子宫黏膜肌层的肥大细胞 甲苯胺蓝400×；V. 血管；G. 腺体；箭头所示为肥大细胞Fig.1 Distribution and morphology of mast cells in the rat uterusA. Mast cell in the submucosal of uterus, Toluidine blue staining, 200×; B. Mast cell around the lower blood vessels in the submucosal layer of uterus, Toluidine blue staining, 200×; C. Mast cells next to the gland of uterus, Toluidine blue staining, 400×; D. Mast cell in the mucous membrane of uterus, Toluidine blue staining, 400×; V. Blood vessel; G. Gland; The arrow points to the mast cells

大鼠子宫肥大细胞的分布基本一致，肥大细胞呈圆形、椭圆形或梭形，胞浆内充满紫红色的异染性颗粒，并存在脱颗粒现象，单个散在分布于子宫中，主要分布在子宫肌层，子宫黏膜肌层平滑肌束间结缔组织近小血管壁以及微血管附近居多，子宫腺周围也有分布，子宫内膜上皮中未发现(图2)。

2.3 苯甲酸雌二醇对去卵巢骨质疏松模型大鼠子宫肥大细胞数量的影响

苯甲酸雌二醇对去卵巢骨质疏松模型大鼠子宫肥大细胞数量的影响(表3)。

表3 各组大鼠子宫横断面全层肥大细胞数量比较Table 3 The number of mast cells in the rat uterus

如表3所示，大鼠卵巢摘除后，子宫肥大细胞的数量较Sham组明显增多，且差异极显著(P<0.01)；给药苯甲酸雌二醇后，子宫肥大细胞的数量与Sham组相比差异不显著(P>0.05)，与OVX组相比，雌二醇给药后肥大细胞数量较OVX组显著减少。上述变化表明，随着大鼠体内雌激素水平的降低，子宫肥大细胞数量呈递增趋势。

3 讨论

3.1 苯甲酸雌二醇对卵巢摘除大鼠子宫形态的影响

哺乳动物的子宫是卵巢雌激素的靶器官，卵巢雌激素对于维持子宫内环境的稳定具有重要的意义。我们前期的的实验结果也表明，卵巢去除手术后3个月，与Sham组相比，OVX组大鼠子宫腔径显著变小，子宫肌层和黏膜上皮均明显变薄，固有层子宫腺减少[3]。子宫的上述组织形态学变化证实雌性动物子宫黏膜的形态受卵巢雌激素的直接调节。这与人类的研究结果一致[8]。本研究结果显示给药苯甲酸雌二醇28 d后大鼠子宫形态恢复正常，子宫黏膜厚度、子宫腔径、子宫黏膜上皮厚度等均较OVX组显著增加，证实雌激素是子宫生理的主要调节剂。

3.2 苯甲酸雌二醇对卵巢摘除大鼠子宫内MC数量的影响

Paul Ehrlich在1878年首次发现肥大细胞(mast cells，MC)，认为其在免疫系统中发挥多种作用。肥大细胞在非特异性免疫中是重要的黏膜免疫相关细胞，其能够分泌细胞因子从而参与获得性免疫[9]。正常情况下，肥大细胞分布于机体结缔组织、消化道和呼吸道黏膜、子宫内膜、以及血管、淋巴管周围，肥大细胞的这种分布可使其分泌的细胞因子能被血管内皮细胞、呼吸道、胃肠道、子宫平滑肌细胞所利用[10]。研究表明哺乳动物(包括啮齿类动物)子宫肥大细胞数量在发情周期中会发生波动，推测可能与雌激素以及孕酮的分泌活动有关，许多研究证实仓鼠、小鼠子宫内肥大细胞数量在发情周期中发生波动[5,6]，但是这些研究仅集中于发情周期，没有涉及去卵巢。本研究运用去除大鼠双侧卵巢阻断雌激素的主要来源，发现去卵巢大鼠由于体内雌激素水平的骤降导致子宫肥大细胞数量较Sham组大鼠急剧增加，给予去卵巢大鼠苯甲酸雌二醇28 d后，其子宫肥大细胞的数量又趋于正常，研究数据显示雌激素水平的变化是导致子宫肥大细胞数量发生波动的重要原因。

近年来，有关激素和肥大细胞介导的免疫系统之间的相互作用、相互调节机制的研究很多[11-13]。研究显示子宫中肥大细胞的数量是衡量子宫局部细胞免疫水平的指标，较外周血T细胞数量指标更精确，可直接反映子宫局部细胞免疫水平的变化[9]。本文研究发现大鼠卵巢去除后，大鼠子宫内MC的数量增多，注射外源苯甲酸雌二醇后子宫肥大细胞数量减少，提示雌二醇对子宫MC数量有直接的影响，子宫可能通过改变MC的数量调节子宫局部免疫状态。卵巢摘除后雌激素水平显著降低，子宫可能通过增加肥大细胞的数量调节局部免疫功能，使机体处于恒定的状态。Narita等[14]的研究认为，雌激素可使肥大脱颗粒，甚至细胞崩解，高浓度雌激素使肥大脱颗粒， 导致其数量减少， 这与本试验结果相一致。子宫内MC数量呈动态变化的特性，原因在于其所处器官局部微环境的不恒定性，即激素水平的不断变化，这可能是子宫为适应生理功能的变化而通过肥大细胞对局部免疫的一种调节方式。本研究还表明，肥大细胞在正常子宫肌层中的数量明显多于子宫内膜，证实子宫肌层中肥大细胞参与正常子宫平滑肌的收缩。