富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死BMP-2/Smads通路的影响

张波 韦冰丹 甘坤宁 崔向荣 熊凯

南宁市第二人民医院创伤骨科手外科，广西 南宁 530031

股骨头坏死是由于股骨头血液供应破坏或骨细胞死亡引起的病理过程，病变可导致关节软骨破坏、股骨头塌陷及髋关节功能丧失等病情[1]。股骨头坏死后期病情致残率高，严重影响患者的健康水平和生活质量。近年研究表明，非创伤性股骨头坏死股骨头局部BMP的表达过低，这可能是影响坏死骨修复与重建的重要原因。富血小板血浆(PRP)及骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有修复软组织功能和分化为骨细胞、软骨细胞等功能[2]。本研究富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞基于BMP-2/Smads信号通路对兔股骨头坏死的影响，为其进一步研究开发提供科学的基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

新西兰大白兔，SPF级，雌雄各半，体重2.6～3.2 kg，由广西医科大学实验动物中心提供，试验动物生产许可证SCXK(桂)2011-0003，试验动物合格证SCXK(桂)2011-0005。将新西兰大白兔随机分为：空白组、模型组、PRP(3%)组、BMSCs(1×106/mL)组、PRP(3%)+ BMSCs(1×106/mL)组，每组10只。

图1 组织HE染色结果(×200)Fig.1 The results of HE staining (×200)HT6SS〗A：空白组 B：模型组 C：PRP组 D：BMSCs组 E：PRP + BMSCs组A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

1.2 仪器与试剂

H-DMEM培养基：北京索来宝，批号：Lot.No.20140516；标准胎牛血清：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号：NWJ1473；胰蛋白酶：北京索来宝，批号：Lot.No.20140702；BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2抗体：武汉博士德生物工程公司；大肠杆菌内毒素：Sigma 公司，批号：L-2630；垂直电泳仪、转膜及显影设备：BIO-RAD公司；酶免分析仪：美国Thermo Forma公司。

1.3 实验方法

1.3.1PRP制备：兔股静脉取血5 mL，采用改良的Appel法[3]制备富血小板血浆，制备的PRP的终浓度为3%，备用。

1.3.2BMSCs培养：新生兔断颈法处死，采用Kopen的方法[4]培养并纯化出BMSCs细胞液，调节细胞浓度为1×106/mL。

1.3.3兔股骨头坏死模型的建立[5]及给药方法：向新西兰大白兔静脉注射10 μg/kg大肠杆菌内毒素两次，注射间隔为24 h。第二次注射大肠杆菌内毒素后，臀肌注射甲基强的松龙20 mg/kg，注射3次，每次注射间隔为24 h。甲基强的松龙注射4 w后，分别对不同实验组兔股骨头内髓芯减压后注射RPR(0.4 mL 3%)、BMSCs(1 mL 1×106/mL)、BMSCs (1 mL 1×106/mL)+ PRP(0.4 mL 3%)，每周注射1次，连续注射4周。空白组及模型组不注入任何物质。

1.3.4观察指标：造模12 w后处死动物，切取股骨头固定、包埋、切片、观察病理学变化。对股骨头进行HE染色观察兔股骨头骨髓腔内的病理学及骨陷窝空缺率变化情况。酶联免疫(ELISA)法检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白水平的变化。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 病理学组织观察

空白组软骨细胞均匀，排列整齐；骨髓腔内骨小梁完整，成骨细胞多。模型组软骨细胞排列紊乱，大小不一，破骨细胞较多，脂肪细胞数量显著增加。与模型组相比，PRP、BMSCs治疗组软骨细胞排列较整齐，成骨细胞有所增加，脂肪细胞明显减少。

2.2 PRP与BMSCs对骨陷窝空缺率的影响

与空白组相比，模型组骨陷窝空缺率显著增加(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组的骨陷窝空缺率明显下降(P<0.05)。结果见图2，表1。

图2 PRP与BMSCs对骨陷窝空缺率的影响(×400)Fig.2 The effect of PRP and BMSCs on lacuna vacancy rate (×400)A：空白组 B：模型组 C：PRP组 D：BMSCs组 E：PRP+ BMSCs组A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

组别骨陷窝空缺率(%)空白组5.74±1.05模型组21.31±1.94∗PRP组16.08±1.87∗▲BMSCs组14.25±1.19∗▲PRP+ BMSCs组11.89±1.46∗▲

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.3 PRP与BMSCs对兔血清中VEGF的影响

与模型组相比，各治疗组血清中 VEGF的含量均有所上升，差异有显著性意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 PRP与BMSCs对兔血清中VEGF的影响Table 2 The effect of PRP and BMSCs on serum levels of VEGF in rabbits

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.4 PRP与BMSCs对股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2表达的影响

与空白组相比，模型组股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型相比，各治疗组股骨头组织中的BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白水平明显上升，其中PRP+BMSCs组水平上升地最高(P<0.05)。结果见表3，图2。

组别BMP-2Smad1Smad5Runx2空白组0.55±0.120.42±0.150.31±0.100.46±0.15模型组0.39±0.11∗0.21±0.08∗0.17±0.07∗0.28±0.06∗PRP组0.67±0.08∗▲0.56±0.14∗▲0.42±0.19∗▲0.57±0.17∗▲BMSCs组0.74±0.14∗▲0.62±0.15∗▲0.53±0.08∗▲0.65±0.22∗▲PRP+ BMSCs组0.98±0.25∗▲0.74±0.26∗▲0.65±0.17∗▲0.96±0.19∗▲

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

图3 PRP与BMSCs对股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Run2表达的影响Fig.3 The effect of PRP and BMSCs on the expressions of BMP-2, Smad1, Smad5, and Run2 in the femoral head

3 讨论

股骨头坏死在临床上可分为创伤性和非创伤性两大类别。外伤所致的股骨头损伤、股骨颈骨折等引起股骨头血运障碍的股骨头坏死的发病机制目前研究已经基本明确[6]。激素、酒精、放射性损伤、一些全身性疾病等繁杂因素而造成的非创伤性股骨头坏死的发病机制尚未完全明确[7,8]。因此针对性的治疗比较困难，对股骨头坏死最佳的治疗方法仍在不断的探索进行中。

骨形态发生蛋白(BMP)是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，是转化生长因子(TGF)-β超家族中最大的一族。可通过体内自分泌和旁分泌形式分泌出BMP，经信号转导并经配体与细胞表面I型和II型BMP受体的结合，从而诱导骨、软骨及骨相关结缔组织的形成[9]。其中BMP-2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的细胞外信号分子。近年研究表明，非创伤性股骨头坏死股骨头局部BMP的表达过低，这可能是影响坏死骨修复与重建的重要原因。Smads蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，分为9个亚型。BMP可激活Smad1、Smad5、Smad8的Smads蛋白亚型，从而诱导调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录Runx2的基因表达[10]。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类中胚层来源的干细胞，为骨组织工程的首选种子细胞。在机体内骨的形成和损伤后的修复中发挥着重要的作用[11]。富血小板血浆(PRP)是通过离心的方法从自体血中提取出来的血小板浓缩物。含有多种生长因子(TGF-β、VEGF)与纤维蛋白原。实验结果显示，PRP与BMSCs能改善股骨头坏死的恢复情况，上调BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白的表达。且PRP与BMSCs的治疗效果最好。可见PRP与BMSCs同时应用时产生协同作用，PRP促进BMSCs的增殖与分化，提供股骨修复中所需的生长因子，通过上调BM P-2的蛋白水平，激活Smads信号通路，继而诱导调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录Runx2的基因表达，促进成骨细胞分化及骨的形成，加速骨组织的修复与愈合。