珠子参皂苷与BMSCs联用治疗大鼠肝纤维化作用研究

张继红　王海燕　石孟琼　刘　雄　周继刚　谈燕清　罗　涛　李浩然　田培琳

(1. 三峡大学 中医临床医学院&宜昌市中医医院， 湖北 宜昌　443000；2. 三峡大学 医学院， 湖北 宜昌　443002)



珠子参皂苷与BMSCs联用治疗大鼠肝纤维化作用研究

张继红1王海燕1石孟琼2刘雄1周继刚1谈燕清1罗涛1李浩然1田培琳1

(1. 三峡大学 中医临床医学院&宜昌市中医医院， 湖北 宜昌443000；2. 三峡大学 医学院， 湖北 宜昌443002)

摘要：观察珠子参皂苷与骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)联用对四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化损伤的治疗作用．实验大鼠腹腔注射50%CCl4(2和1 mL/kg/周)，连续8周制备大鼠肝纤维化模型，注射2周后灌胃给予珠子参皂苷(200 mg/kg)，正常组和模型组灌胃给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，共8周；在第5周，其中的珠子参皂苷组大鼠尾静脉注射5×106/0.5 mL/只Dil标记BMSCs，7 d后，用荧光显微镜检测BMSCs向大鼠肝组织募集情况；8周后取血清，检测谷丙转移酶(ALT)、谷草转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)水平；检测肝组织羟脯氨酸(Hyp)水平和病理学变化，计算纤维化分级、胶原纤维和网状纤维面积比．结果表明珠子参皂苷可显著促进BMSCs定向募集至肝脏受损部位，珠子参皂苷和其与BMSCs联用均可明显改善肝功能，降低血液中ALP、ALT、AST水平，增加TP、ALB水平和A/G，降低肝纤维化分级、胶原纤维和网状纤维面积比及Hyp水平，改善肝脏组织形态学(P<0.05或P<0.01)，尤以珠子参皂苷与BMSCs联用组效果最为显著．本研究为珠子参皂苷与BMSCs联合应用治疗肝纤维化损伤提供了实验依据．

关键词：珠子参皂苷；肝纤维化；骨髓干细胞

骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)移植在治疗肝纤维化等方面有了很大的进展，以其费用低廉、取材方便、不存在免疫排斥反应等越来越受到重视．近年来，其在临床应用越来越广泛．中药在治疗肝纤维化损伤方面有其独到优势和特点，但关于中医药对BMSCs的影响，促进肝细胞再生方面的研究尚十分匮乏．珠子参为五加科植物RhizomaPanacismajoris的根，为土家族传统的草药．近年来，研究发现珠子参皂苷对CCl4引起的大鼠肝纤维化损伤具有保护作用及可促进BMSCs分化为肝细胞[1]．本研究在此基础上，观察珠子参皂苷与BMSCs联用诱导BMSCs募集和对大鼠肝纤维化的治疗作用，为珠子参皂苷与BMSCs联合临床应用治疗肝纤维化提供依据．

1材料与方法

1.1实验药物

珠子参药材购自神农架林区，经三峡大学生物技术中心王玉兵博士鉴定为五加科人参属植物珠子参的根状茎，珠子参皂苷皂苷含量为92.65%，制备参照文献[2]．

1.2实验动物

体质量为180～220 g的雄性Sprague-Dawley(SD)资料大鼠购自武汉大学实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0004．

1.3主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清：美国Gibco公司；胰蛋白酶：美国Sigma公司；台盼蓝、氮唑溴盐(MTT)：二甲基亚砜(DMSO)：美国Amresco公司；Dil-dye：invitrogen公司；CCl4：成都市科龙化工试剂厂；橄榄油：西班牙托雷斯和利贝雷斯公司；谷丙转移酶(ALT)、谷草转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、羟脯氨酸(Hyp)：南京建成生物科技有限公司；其它试剂为市售分析纯．

1.4实验仪器

H-7500透射电子显微镜：日本日立公司；NIKON TE2000型荧光倒置显微镜：上海衡桥仪器有限公司；Olympus KX41型倒置显微镜、3111 CO2培养箱：美国Thermo；ADVIA1200全自动生化分析仪，国西门子公司．

1.5方法

1.5.1BMSCs分离与标记

在无菌条件下处死SD大鼠，取出股骨，用细胞培养基(含10.0%胎牛血清)冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心收集沉淀后，加入预冷的NH4Cl溶液，混匀后，再次离心，收集沉淀，将其用细胞培养基(含10.0%胎牛血清)按2×106/mL密度接种到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中培养，48 h后换液一次细胞，当细胞单层长到80%时，进行传代培养，然后用5×106/0.5 mL Dil标记的BMSCs后继续培养．

1.5.2大鼠肝纤维化模型的建立及分组

将SD大鼠完全随机分为正常组、肝纤维化模型组、BMSCs组、珠子参皂苷200 mg/kg组、BMSCs+珠子参皂苷200 mg/kg组5组．除空白组外，其余各组大鼠分别按2和1 mL/kg于周二和周五腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液，每周2次，空白组注射同体积橄榄油．2周后，各注射CCl4溶液组大鼠饮水中加入苯巴比妥(350 mg/L)，同时各组大鼠灌胃给予对应的药物，正常组和模型组灌胃给予同体积的生理盐水溶液，每天给药1次，连续8周．在实验的第5周，BMSCs组和BMSCs+珠子参皂苷200 mg/kg组大鼠按5×106/0.5 mL/只尾静脉注射Dil标记的BMSCs，其他组注射同体积的生理盐水，然后各组继续给药．

1.5.3BMSCs在肝纤维化大鼠体内分布检测

在尾静脉注射Dil标记的BMSCs 7 d后，随机选取尾静脉注射BMSCs的模型组和珠子参皂苷与BMSCs联用组3只大鼠，处死后，迅速去除肝脏，进行冰冻切片后，用荧光显微镜观察BMSCs在肝纤维化组织中的分布情况．

1.5.4大鼠体质量和肝指数的计算

分别称重给药前的体质量、每周的体质量；第8周末，实验大鼠麻醉后腹腔主动脉取血分离血清，取肝脏，并称量其质量，计算肝脏指数(g/g×1 000)．

1.5.5血液指标检测

分离大鼠血清后，用生化分析仪测定其中的AST、ALB、ALP、ALT和TP的含量及白蛋白/球蛋白(A/G)．

1.5.6肝组织中Hyp检测

分别取各实验大鼠进行肝组织进行匀浆，测定Hyp含量．具体方法按照试剂盒的说明书进行．

1.5.7肝组织形态学分析

肝组织经切片和HE染色后，进行肝纤维化分析．分析时按照改良Knodell评分方法进行[3]．

1.6统计学处理

2结果

2.1珠子参皂苷对BMSCs向大鼠肝组织募集的影响

荧光显微镜观察发现，实验大鼠移植经Dil标记

BMSCs 7 d后，模型组大鼠肝组织中仅有少量Dil标记的BMSCs(发红色荧光)，而用珠子参皂苷治疗后，大量Dil染色标记的BMSCs．实验结果表明，珠子参皂苷可显著促进BMSCs定向募集至肝脏受损部位(图1)．

图1　珠子参皂苷对BMSCs向大鼠肝组织募集的影响

2.2珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠体质量和肝指数的影响

由表1可知，造模前和大鼠体质量无明显差异，在用CCl4造模后，其体重增长速度较正常组明显降低(P<0.01)；用珠子参皂苷治疗后，体质量有明显的改善；在肝重和肝脏指数方面，模型组均出现显著升高；珠子参皂苷及与BMSCs联用治疗后，均出现了明显的降低，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，尤以珠子参皂苷与BMSCs联用组效果最为显著．

表1　珠子参皂苷与BMSCs联用对肝纤维化模型大鼠体质量和肝指数的影响±s，n=8)

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

2.3珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠肝功能的影响

由表2可知，模型组大鼠血液中ALT、ALP和AST含量显著增加，ALB、TP含量和A/G值显著降低，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；珠子参皂苷及与BMSCs联用治疗后，ALT、ALP、AST、ALB、TP含量及A/G值均得到改善，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中以珠子参皂苷与BMSCs联用组作用效果最为显著．

表2　珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠肝功能的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

2.4珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠肝纤维化的影响

如表3和图2所示，正常组肝索排列规则有序，肝小叶结构清晰正常；模型组肝细胞弥漫性脂肪变性，肝索排列杂乱，肝小叶可见炎性浸润，胶原纤维、网状纤维沉积异常增多；珠子参皂苷及与BMSCs联用后，肝细胞炎性浸润和脂肪变性均显著降低，胶原和网状纤维样变得到有效遏制．经改良Knodell评分分析：模型组肝纤维化、胶原纤维面积、网状纤维面积比和Hyp水平均明显升高，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；珠子参皂苷与BMSCs联用后，上述异常改变均得到显著的逆转(P<0.05或P<0.01)，其中以珠子参皂苷与BMSCs联用组作用效果最为明显．

表3　珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠肝纤维化的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

A：正常组；B：模型组；C：BMSCs移植组；D：珠子参皂苷组；E：BMSCs移植+珠子参皂苷组HE染色图2　珠子参皂苷与BMSCs联用对大鼠肝纤维化的影响

3讨论

干细胞是一类具有多向分化潜能的原始细胞，虽然具有较强的分化潜能，但是在机体内复杂的微环境中，很难确保其较长时间向单一方向分化，加之机体移植后存在成肿瘤(如畸胎瘤)的风险和伦理等诸多问题，在一定程度上限制了其在临床上的推广应用[4-5]．近年来，国内外的许多科学家相继研究发现BMSCs的分化能力是最为接近胚胎干细胞的成体干细胞，在一定条件下，它可以分化成为心、肝、脑、肌肉、软骨、胰岛等多种体细胞[6]．BMSCs因其来源丰富，自体移植可避免疫排斥反应，不涉及伦理等诸多优点而倍受关注，充分开发利用BMSCs，将为心、肝、脑等重要器官致命性疾病的治疗开辟一条新的道路．

我国在20世纪80年代就开展了中药对BMSCs的生物学影响研究，应用中药治疗血液病、抗放化疗副作用等取得了很好的临床效果[7-8]．由于乙肝患者在我国仍拥有大量的人群，加之人们不合理的饮食、饮酒习惯，使得了肝脏疾病在我国高居不下，肝纤维化、肝硬化、肝癌和肝衰竭已成为当前临床防治的重点．干细胞移植为治疗终末期肝病提供了新的希望，而BMSCs以其独特的优势，得到了许多研究者的青睐．为此积极开展中药干预BMSCs动员、扩增、定向分化、移植等方面的研究具有重要的重要意义和应用价值．近年来，研究发现珠子参皂苷对CCl4引起的大鼠肝纤维化损伤有较好的保护作用，证实与延缓肝细胞衰老和促进肝细胞增殖密切相关[1]；在体外实验中，发现珠子参皂苷可诱导BMSCs分化为肝细胞，使其具有了合成糖原、摄取低密度脂蛋白及分泌尿素的能力．在本实验研究中，通过观察珠子参皂苷与BMSCs联用对肝纤维化大鼠的治疗作用发现，珠子参皂苷可促进BMSCs定向募集至肝脏受损部位，降低血液中ALP、ALT、AST水平，增加TP、ALB水平和A/G比值，降低肝组织Hyp含量和肝纤维化，改善肝脏组织形态学．本研究为珠子参皂苷与BMSCs联合应用治疗肝纤维化损伤提供了实验依据．

参考文献：

[1]张继红,邓为,石孟琼,等．珠子参皂苷对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用[J]．中药药理与临床,2014,30(5)：73-78．

[2]金家红,贺海波,石孟琼,等．珠子参总皂苷对小鼠局灶性脑缺血的保护作用[J]．第三军医大学学报,2011,33(24)：2631-2633．

[3]Brunt E M. Grading and Staging the Histopathological Lesions of Chronic Hepatitis： the Knodell Histology Activity Index and Beyond[J]．Hepatology, 2000,31(1)：241-246．

[4]Efimenko A Y, Kochegura T N, Akopyan Z A, et al. Autologous Stem Cell Therapy： How Aging and Chronic Diseases Affect Stem and Progenitor Cells[J]． Biores Open Access， 2015,4(1)：26-38．

[5]Heslop J A, Hammond T G, Santeramo I, et al. Concise Review： Workshop Review： Understanding and Assessing the Risks of Stem Cell-based Therapies[J]． Stem Cells Transl Med, 2015,4(4)：389-400．

[6]Saleh M, Shamsasanjan K, Movassaghpourakbari A, et al. The Impact of Mesenchymal Stem Cells on Differentiation of Hematopoietic Stem Cells[J]． Adv Pharm Bull, 2015,5(3)：299-304．

[7]Dong S, Su S B. Advances in Mesenchymal Stem Cells Combined with Traditional Chinese Medicine Therapy for Liver Fibrosis[J]． J Integr Med, 2014,12(3)：147-155．

[8]方健康,周轶平,李玛琳.中药对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及分化的影响研究进展[J]．中国中药杂志,2014,39(15)：2834-2837．

[责任编辑周文凯]

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.03.023

收稿日期：2015-11-28

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81341141)；湖北省卫生厅项目(No. 2011JX5C21)

通信作者：石孟琼(1971-)，女，实验师，主要从事中药药理研究．E-mail：shmq0212@126.com

中图分类号：R282.71

文献标识码：A

文章编号：1672-948X(2016)03-0104-04

Therapeutical Effect of Saponins fromRhizomaPanacisMajorisCombined with BMSCs on Hepatic Fibrosis Induced by CCl4in Rats

Zhang Jihong1Wang Haiyan1Shi Mengqiong2Liu Xiong1Zhou Jigang1Tan Yanqing1Luo Tao1Li Haoran1Tian Peilin1

(1. Traditional Chinese Medicine Clinical Hospital, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China; 2. Medical Science College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractThe aim is to observe the therapeutical effect of saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs on hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats. The rat model of hepatic fibrosis was induced by intraperitoneal injection of CCl4. After the two weeks, the two groups selected were orally given saponins from Rhizoma Panacis Majoris (200mg/kg), the rest of the normal and model groups were given equal volume of 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution, once a day for 8 weeks. On the fifth week, the one group of two saponins treated group was injected bone marrow stem cells (BMSCs) labeled Dil by tail vein, and the floatations of BMSCs in rat liver tissued were detected by fluorescence microscope after the eighth day. Treatment with saponins from Rhizoma Panacis Majoris for eight weeks later, serum glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (ALB) were detected; Liver tissue hydroxyproline (Hyp) content and morphology, grading of liver fibrosis, ratio of collagen fiber area and reticular fiber area were evaluated by HE staining; Our study showed that saponins from Rhizoma Panacis Majoris significantly promoted the BMSCs directed recruitment to the damaged part of the liver; Saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs could significantly improve liver function, decrease serum ALP, ALT, AST contents, increase TP, ALB contents and A/G ratio, decrease the liver tissue Hyp content, grading of liver fibrosis, ratio collagen fiber area and reticular fiber area, improve liver tissue morphology (P<0.05 or P<0.01, respectively), especially saponins from Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs group. This study provides an experimental basis for the application of Rhizoma Panacis Majoris combined with BMSCs in the treatment of hepatic fibrosis.

KeywordsRhizoma Panacis Majoris;hepatic fibrosis;bone marrow stem cells