RP-HPLC法同时测定果酒中13种酚类化合物

王滢雪，刘雪平，孙翔宇，侯彩云，战吉宬（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市葡萄科学与酿酒技术重点实验室，北京100083）

RP-HPLC法同时测定果酒中13种酚类化合物

王滢雪，刘雪平，孙翔宇，侯彩云，战吉宬
（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市葡萄科学与酿酒技术重点实验室，北京100083）

摘要：建立了一种适用于多种果酒中13种多酚类化合物（5种黄烷-3-醇、4种黄酮醇、2种酚酸、2种芪类）含量测定的HPLC分析方法。色谱条件为：LiChrospher 100 RP-18e柱，流动相A为水（0.1%磷酸），流动相B为甲醇（0.1%磷酸），梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，检测波长为272 nm。在该色谱条件下各个物质在48 min内得到了良好的分离，各物质的含量与峰面积呈良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.998，且回收率在73%～123%之间，重复性好，具有定量准确、快速等特点。运用该方法测定了6种葡萄酒、7种蓝莓酒、5种桑葚酒中13种酚类化合物的含量。结果表明，葡萄酒中含有全部13种多酚化合物，蓝莓酒中有10种，桑葚酒中有9种。葡萄酒中黄烷-3-醇的含量较高，蓝莓酒和桑葚酒中黄酮醇的含量较高，葡萄酒和桑葚酒均含有白藜芦醇，蓝莓酒不含。该方法准确、可靠，可适用于多种果酒中13种酚类化合物的测定。

关键词：果酒； 酚类化合物； 反相高效液相色谱

果酒是以新鲜水果或果汁为原料，经过破碎、压榨取汁、发酵、澄清、陈酿等工艺精心酿制调配而成的低度饮料酒。根据国家优质食品评选标准（果酒部分），按原料不同将果酒分为7类：北方浆果类、仁果类、核果类、柑橘类、猕猴桃类、山楂类和枣类［1］。葡萄、蓝莓、桑葚等浆果中含有丰富的黄烷-3-醇、黄酮醇、酚酸、芪类等多酚类物质，并且有较高的抗氧化性，其保健功能越来越为人们所知。近年来，随着人们对保健型果酒的消费需求越来越大，葡萄酒、蓝莓酒、桑葚酒等浆果类果酒也越来越多的引起人们的重视［2］。多酚类物质不仅与果酒的色泽、风味等品质指标密切相关，而且赋予了果酒一定的保健功效和抗氧化能力［3-7］。所以，对果酒中重要多酚类物质的分析检测具有重要意义。

多酚类物质主要结构是苯环，其结构中有一个或多个羟基组。基于它们碳环结构的差异，可将多酚划分为类黄酮和非类黄酮类物质。果酒中，类黄酮主要是黄烷醇、黄酮醇、花青素类等，非类黄酮类物质主要是酚酸和芪类（白藜芦醇）等［3］。研究发现［2-20］，葡萄酒、蓝莓酒、桑葚酒中含量较高的主要多酚类化合物见表1。

表1　葡萄酒、蓝莓酒、桑葚酒中主要酚类化合物

近年来，许多学者用HPLC法对果酒中酚类物质进行了研究［8-11］。但在这些研究中，多为分别测定酚酸、黄烷-3-醇、黄酮醇、芪类，并只适用于某一种果酒，很少见到在同一色谱条件下，较短时间内将果酒中主要的、含量较高的黄烷-3-醇、黄酮醇、芪类等酚类化合物同时分离测定的报道。

本研究采用梯度洗脱程序，建立了果酒中主要的、含量较高的13种多酚类化合物含量测定的HPLC分析方法。13种多酚类化合物包括：5种黄烷-3-醇（儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯）、4种黄酮醇（槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷），2种酚酸（没食子酸、阿魏酸），2种芪类（白藜芦醇、虎杖苷）。并且，采用建立的HPLC方法对7个品种的蓝莓酒、6个品种的葡萄酒、5个品种的桑葚酒进行了含量检测，获得了满意的结果。

1　材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

样品：6个品种的葡萄酒（赤霞珠、美乐、西拉、马瑟兰、蛇龙珠、黑比诺），为2012年产自怀来；7个品种的蓝莓酒（蓝丰、公爵、达柔、圆蓝、芝妮、杰兔、美登），由实验室酿制；5个品种桑葚酒（红果、龙桑、沙霓、大十、白玉王），由实验室酿制。

仪器设备：Waters-2695高效液相色谱仪，美国Waters；PDA紫外检测器Waters-2996，美国WatersAUY220；色谱柱LiChrospher 100 RP-18e，德国Merck；KQ-300TDE型高频数控超声波清洗机；AUY220分析天平，日本SHIMADZU；SHB-Ⅲ循环水式真空泵，河南予华。

试剂：儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷、没食子酸、阿魏酸、白藜芦醇、虎杖苷标准品均购于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（色谱级），赛默飞世尔科技公司；磷酸（色谱级），成都西亚化工股份有限公司；乙酸乙酯（分析纯），北京化工厂。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：LiChrospher 100 RP-18e反相C18柱，流动相A为水（0.1%磷酸），流动相B为甲醇（0.1%磷酸）。梯度洗脱：0～10 min，B为10%～37%；10～17.5 min，B为37%；17.5～18.5 min，B为37%～40%；18.5～26 min，B 为40%；26～27 min，B为40%～54%；26～47 min，B为54%；47～48 min，B为10%。流速为0.5 mL/min，检测波长为272 nm，进样量10 μL。

1.2.2标准溶液的配制

准确称取儿茶素、表儿茶素等13种标准品各25.0 mg，分别用90%甲醇水溶液定容至5 mL棕色容量瓶中，得到各标准品的标准储备液，-30℃保存备用。使用前，根据实验需要将标准储备液用甲醇稀释至适合浓度配制成标准工作液和混合标准工作液。

1.2.3样品处理

取果酒25 mL，以2倍料液比用乙酸乙酯萃取3次，取出酯相合并，35℃旋蒸至干。残渣溶于5 mL 90%甲醇水溶液，过0.45 μm滤膜，作为样品溶液。

1.2.4方法学考察

线性关系与检出限：在最佳色谱条件下，选取定量下限浓度以上的不同浓度混合标准工作液进行液相分析，分别获得各自的峰面积，通过建立样品浓度与峰面积的标准曲线，计算标准曲线的回归方程及相关系数，考察线性相关性。将配制的混合标准品储备液逐步稀释，并以信噪比（RSN）为3时所对应的标准溶液中所含组分的含量为检出限（LOD）。

精密度与加标回收率：向已知单体酚含量的样品5份，定量精密添加标准品的混合标准工作液，充分混匀后按照1.2.3制备样品（n=5）。在最佳条件下测定13种物质的回收率。

重复性与稳定性：取同一批次的样品溶液，在最佳条件下连续测定5次，记录峰面积与保留时间，并计算各物质的含量，计算RSD值，分析样品的重复性。取同一批次的样品溶液，在最佳条件下分别于0、4 h、8 h、16 h、24 h进样，记录峰面积与保留时间，并计算各物质的含量，计算RSD值，分析样品的稳定性。

1.2.5样品测定

以该方法分别测定葡萄酒、蓝莓酒、桑葚酒3种果酒中13种物质的含量，分析方法对于样品的适用性。

2　结果与讨论

2.1色谱条件的选择

2.1.1检测波长的选择

用PDA检测器对儿茶素等13种物质标准样品溶液进行最大吸收光谱扫描。13种物质的吸收光谱图显示，标准样品的最大吸收峰虽然各不相同，但在272 nm处均有最大或者较大吸收峰。综合考虑，选取272 nm作为检测波长为宜。

2.1.2柱温与流速的选择

实验比较了色谱柱温度在25.0℃、30.0℃、35.0℃和40.0℃4个柱温条件下13种酚类物质混合标准品以及样品中色谱峰的分离情况。结果发现，在所考察的4个温度条件中，30.0℃的分离度最佳，因此本实验采用色谱柱温为30.0℃。同时，实验比较了流动相流速在0.1～1.0 mL/min内13种酚类物质混合标准品以及样品中色谱峰的分离情况，结果发现，流速为0.5 mL/min时，出峰效果最好，确定流速为0.5 mL/min。

2.1.3梯度洗脱条件

实验对洗脱梯度进行优化，确定洗脱程序：0～10 min，B为10%～37%；10～17.5 min，B为37%；17.5～18.5 min，B为37%～40%；18.5～26 min，B为40%；26～27 min，B为40%～54%；26～47 min，B为54%；47～48 min，B 为10%。在此梯度洗脱条件下，13种酚类物质达到很好的色谱分离，标样色谱图见图1，样品色谱图见图2。

图1　13种酚类物质标准品色谱图

2.2线性关系与检测限

13种酚类化合物的浓度范围、线性方程、相关系数和检出限结果见表2。从表2可以看出，没食子酸等13种物质标准品的相关系数（R2）均大于0.998，质量浓度和相应峰面积呈良好线性关系。并且它们的最低检测限都较低，能满足定量分析要求，说明此方法灵敏度较高。

图2　样品色谱图

2.3精密度与加标回收率

最佳色谱条件下，13种物质的回收率结果见表3。13种物质的回收率为73%～123%，回收率的RSD在5.0%以下。结果表明，该方法精密度良好，加标回收率符合要求。

2.4重复性与稳定性

重复性：最佳色谱条件下，5份样品测定结果显示，13种物质峰面积RSD为0.51%、0.58%、0.44%、0.92%、0.63%、1.97%、1.78%、0.50%、1.83%、1.26%、1.11%、0.79%，表明该方法重复性良好。

稳定性：最佳色谱条件下，同一样品5次测定结果显示，13种物质峰面积RSD为0.79%、1.03%、1.97%、0.25%、1.34%、0.69%、0.69%、1.71%、0.48%、0.62%、0.47%、1.37%，表明该方法稳定性良好。

2.5样品测定

按照色谱条件对6个品种的葡萄酒、7个品种的蓝莓酒、5个品种的桑葚酒进行了含量检测，结果见表4。

表2　13种酚类化合物的保留时间、回归方程、线性范围和检测限

表3　13种酚类化合物的精密度和加标回收率实验结果

表4　葡萄酒样品中13种酚类化合物的含量分析　（mg/L）

测定结果表明，葡萄酒所含酚类化合物种类较多、平均含量较高，尤其是黄烷-3-醇，葡萄酒中含有5种，而蓝莓酒和桑葚酒只含有3种和2种。而就黄酮醇而言，蓝莓酒和桑葚酒中的含量略高于葡萄酒，其中蓝莓酒最高。葡萄酒中没食子酸的含量远远超过蓝莓酒和桑葚酒，且葡萄酒中没食子酸含量因品种不同差异较大，而蓝莓酒和桑葚酒比较稳定，都比较低。葡萄酒和桑葚酒中都含有白藜芦醇，而蓝莓酒中不含，但蓝莓酒中含有虎杖苷，而桑葚酒中不含。

6种葡萄酒中有4种均可检测到13种化合物，其中，马瑟兰和赤霞珠所含酚类化合物相对较多。没食子酸、儿茶素、表儿茶素是葡萄酒中的主要酚类化合物。测定结果与文献报道结果基本一致［9-12］，但本实验葡萄酒样品中的表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯的含量要高于王秀芹等［12］所报道，这可能与葡萄酒样品的品种、产地等不同有关。

与葡萄酒相比，蓝莓酒中黄烷醇的种类和含量相对较低，而黄酮醇的含量相对较高，尤其是槲皮素和槲皮苷。翁芳华等［13］检测到蓝莓酒中含有4种黄烷醇，而本实验中蓝莓酒中能被检测到的黄烷醇只有3种，其中表没食子儿茶素未曾检测到。蓝莓酒的7个品种中，达柔和蓝丰所含酚类化合物较多。7个品种的蓝莓酒中均未检测到白藜芦醇，只有圆蓝检测到了虎杖苷。

桑葚酒中所含酚类化合物的种类与蓝莓酒相似，不同之处在于桑葚酒不含表儿茶素没食子酸酯，而含有白藜芦醇。桑葚酒在所含酚类化合物种类上虽不及葡萄酒，但在黄酮醇的总含量上是超过葡萄酒的，这与李岳珍等［14］所报道的桑葚酒中黄酮醇含量情况的比较是一致的。

表5　蓝莓酒样品中13种酚类化合物的含量分析　（mg/L）

表6　桑葚酒样品中13种酚类化合物的含量分析　（mg/L）

表7　3种酒中13种酚类化合物的平均含量　（mg/L）

3　结论

浆果类果酒风味良好，富含多种酚类物质，同时又兼具良好的保健功能，具有良好的发展前景。但果酒中酚类物质结构复杂、种类繁多，许多酚类物质化学结构和性质相似，使其分离较难。高效液相色谱具有灵敏度高、选择性强、色谱柱的选择范围宽、样品预处理简单等特点，是检测酚类化合物最常用的方法之一。

本实验采用RP-HPLC法，为样品分析提供了较为丰富的定性和定量信息，并通过对流动相、洗脱条件、柱温、流速等色谱条件的优化，在最佳色谱条件下13种酚类物质均得到了很好的分离。经方法学验证，各物质的线性关系良好，检测限低，加样回收率准确度较高，相对标准偏差较好，将方法用于葡萄酒、蓝莓酒、桑葚酒等果酒样品的测定，结果表明该方法准确、可靠，适于果酒中酚类物质含量的分析。为同时测定果酒中不同种类的多酚建立了一种可靠的方法。

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优先数字出版时间：2016-06-16；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160616.1415.001.html。

中图分类号：TS262.7；TS261.7；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0103-06

DOI：10.13746/j.njkj.2016150

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303073-01）。

收稿日期：2016-05-03

作者简介：王滢雪（1991-），女，硕士，研究方向为果酒酿造及检测。

通讯作者：战吉宬（1972-），男，教授，博士，研究方向为葡萄酒化学、葡萄生理生化与分子生物学；侯彩云（1963-），女，教授，博士，研究方向为食品安全检测技术的研究与推广。

Simultaneous Detection of 13 Kinds of Polyphenols in Fruit Wine by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography

WANG Yingxue，LIU Xueping，SUN Xiangyu，HOU Caiyun and ZHAN Jicheng
（Beijing Key Lab of Viticulture and Enology，College of Food Science and Nutritional Engineering，ChinaAgricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract:A new method of RP-HPLC has been developed for simultaneous detection of 13 polyphenols（5 flavan-3-ols，4 flavonols，2 phenolic acids and 2 stilbene）in fruit wine.The separation was performed on a LiChrospher 100 RP-18e column at 30℃.The mobile phase was consisted of 0.1%phosphoric acid（A）and 0.1%phosphoric acid methanol（B），with gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min.The injection volume was 10 μL and a Photo-Diode Array（PDA）was used to monitor signals at 272 nm.Under these chromatographic conditions，13 polyphenols were successfully separated in 48 minutes and their contents showed good linear relationships with the peak areas，R2＞0.998.The method had the advantages of high recovery rate（73%～123%），good repeatability，good accuracy，and rapid detection.The contents of 13 polyphenols in six grape wine products，seven blueberry wine products，and five mulberry wine products were determined by this method.The results suggested that，13，10，and 9 polyphenols could be detected in grape wine，blueberry wine，and mulberry wine，respectively；the content of flavan-3-ols in grape wine was higher，on the other hand，the content of flavonols in blueberry wine and mulberry wine was higher；resveratrol was detected in grape wine and in mulberry wine，while there was no resveratrol in blueberry wine.This mehtod was suitable for the detection of mutiple phenolic compounds in various wine products.

Key words：fruit wine；polyphenols；RP-HPLC