超声波辅助酒精发酵技术

王振斌，刘凤叶，马海乐，王　林，张存胜，闫景坤，刘加友

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

超声波辅助酒精发酵技术

王振斌，刘凤叶，马海乐，王林，张存胜，闫景坤，刘加友

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

摘要：为了促进酿酒工艺的发展，探讨超声波促进酵母酒精发酵的机理，在对超声波处理前后的酵母菌数量、发酵液残糖量、酒精产生量和发酵液黏度研究的基础上，利用扫描电镜和核磁共振技术对超声波处理前后的酵母菌表征和水分子团簇进行了研究。研究结果表明，对照组酵母菌落数和酒精含量分别在42 h和90 h达到最大值2.65×108cfu/mL和4.5 g/L，发酵液黏度逐渐降低，酵母细胞表面形体饱满，无大的凹陷，发酵末期水分子团17O半峰宽为85.39 Hz。超声组相比对照组菌落总数提前18 h达到最大值2.75×108cfu/mL，还原糖消耗速率和酒精产生速率显著加快，发酵液黏度明显低于对照组，酵母细胞形体表面粗糙，出现一定程度的凹陷，发酵末期水分子团17O半峰宽为54.32 Hz。本研究为超声波处理技术在生物发酵工艺方面的应用提供了理论依据。

关键词：酒精发酵； 超声波处理； 发酵速度； 机理

酒文化源远流长，酒类饮品在我们的生活中扮演着非常重要的角色，需要贮存一定的时间，才能很好地提升品质。现在酿酒工艺日渐成熟，发酵法酿造乙醇有悠久的历史，但传统工艺生产效率低、成本过高［1］，已难以满足现代生物发酵工程的需要，迫使人们不断利用相关学科最新的科研成果来改进发酵工艺。现在应用比较多的有一些化学方法［2-4］。迄今，一些物理量如光、电、热、电磁等对发酵过程生物学特性（如酶的活性等）的影响，人们已进行了一定的研究且取得了不少成果。

近年来，由于超声波处理设备的普及和发展，超声波对发酵过程的影响正引起研究者强烈的兴趣和高度的重视，目前已广泛应用于电子、机械、轻工等行业［6-7］。近年来在生物领域的应用愈来愈受到重视［8］，合适强度的超声波作用于发酵液，可改善生物反应条件［9］。在超声波作用下，超声空化，机械作用改变了膜上脂双分子层结构而使微生物细胞膜电位发生改变，激活Ca+、K+等离子通道，膜两侧物质渗透速度即膜的通透性增加，促进对底物的利用和体内代谢物的转移，进而促进了细胞的生长并缩短细胞生长的迟滞时间［10-11］。低强度超声波加载于微生物发酵过程中，可以加速微生物细胞的生长，同时可以促进有益代谢产物的合成。

本研究将超声波技术应用在镇江香醋的传统酿造的酒精发酵过程中，以低强度超声波提高发酵效率、缩短发酵时间，并从不同方面进一步的了解促进的机理，为镇江香醋酿造技术的发展提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料及仪器

菌种：酿酒酵母。

种子培养基：YEPD培养基，115℃灭菌30 min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖50 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，CaC120.06 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，于115℃下灭菌30 min［5］。

仪器设备：CY-5D超声波微生物生长促进仪；752N紫外可见分光光度计；Stemi 30电子显微镜；7890AGC气相色谱；YXQ-LS-50S高压灭菌锅；HYL-C多功能摇床；NMR-500核磁共振谱仪；NDJ-79黏度计；S-3400N钨灯丝扫描电子显微镜。

1.2实验方法

1.2.1菌种发酵

将发酵液分装至6个500 mL三角瓶中，精确量取20 mL菌液于发酵瓶，置于28℃恒温培养箱中进行发酵培养。发酵初期每隔4 h取样1次，发酵末期每隔10 h取样1次。

1.2.2超声波辅助酒精发酵

发酵7 h结束后，取其中3个三角瓶进行超声波处理，处理的条件是超声频率20 KHz，超声功率密度50 W/L，超声时间1 h，工作10 s，间歇2 s。

1.3检测方法

1.3.1酵母菌数目的测定

使用血球计数法结合美兰染色法来确定酵母菌活菌的数量［12］。

1.3.2发酵液中残糖含量测定

采用DNS［13］法（3，5-二硝基水杨酸法）测定。取5 mL发酵液，于5000 r/min离心机中离心10 min，取上清液于540 nm处测其吸光值，并绘制标准曲线，标准曲线为Y= 0.4824X+0.0123，R2=0.9978。对应标准曲线得出相应含量。DNS比色法测定葡萄糖质量浓度即为残糖含量。

1.3.3发酵液中酒精含量测定

采用气相色谱法［14］测定发酵液酒精含量。取2 mL发酵液，经0.45 nm滤膜过滤处理，与甲酸1∶1混合，使用气相色谱仪进行测定，并绘制标准曲线，标准曲线为Y= 17309.0517X+7400.0464，R2=0.9993。

1.3.4发酵液黏度测定

取发酵前、中、后、末期的发酵液于5000 r/min离心机中离心10 min，取上清液使用NDJ-8S型号的旋转黏度计测定黏度。

1.3.5发酵液水分子团17O半峰宽

本研究利用17O-NMR半峰宽研究超声波处理方法对水分子团簇的影响，取发酵前、中、末期发酵液于5000 r/min的离心机中离心10 min，除掉底部沉淀物，将离心后的上清液经过30～50 μm的定性滤纸进行过滤处理得到滤液，采用NMR测定发酵液水分子团17O半峰宽。

1.3.6酵母细胞表面的扫描电镜分析

取超声波处理完成后的发酵液于5000 r/min的离心机中离心10 min，获得底部菌体，并按以下步骤进行处理：

菌体→PBS清洗3次→2.5%戊二醛，4℃固定4 h→PBS清洗3次→乙醇梯度脱水（30%，50%，70%，80%，90%）1次→在15 min/次，5000 r/min，4℃下离心5 min，100%乙醇脱水2次→乙酸异戊二酯置换2次（1-醇∶酯= 1∶1，2-醇∶酯=1∶1）→样品在超净台吹干，进行SEM观察。

PBS：NaCl：5.0 g，Na2HPO4：2.9 g，KCl：0.2 g，KH2PO4：0.2 g。

干燥后的样品在高度真空条件下进行黄金镀层［15］，然后采用S-3400N型号的扫描电镜进行观察。

2　结果与分析

2.1超声波对酵母菌数目的影响

观察超声组培养液发现，发酵8 h后超声组三角瓶的底部出现少许沉淀，经镜检发现是酵母菌的菌体沉淀。通过图1可以发现刚接入的菌体处于迟滞期，发酵不活跃，此时超声组会略微落后于对照组。

对发酵过程酵母活菌数检测可以看出（图1），超声组在发酵24 h后可达到最大活菌数量，为2.75×108cfu/mL，相比对照组提前18 h达到最大活菌数，两组发酵液中的活菌数均在之后30 h内急速下降，直到发酵后期，两组活菌数量基本不再变化。这一变化趋势与糖含量的变化趋势相吻合。证明在发酵底物一样的情况下，低功率超声波处理可以促进细胞快速生长，但对细胞最终数目没有较大影响。此研究结果与高大维等［16］研究结果相一致，用频率为32.5 KHz，功率为30 W的超声辐照啤酒酵母后，细胞的对数生长期延长，细胞生长速率提高，对细胞生长有一定促进作用。这可能是由于超声波在一定程度上可以改变细胞膜的通透性，加速胞内物质的流出和胞外物质的流入，从而促进细胞快速生长。

2.2超声波对发酵液残糖量的影响

酵母发酵过程中利用糖类产生二氧化碳和酒精，糖含量和超声功率密度对发酵进程都有很大的影响［17-18］。发酵过程中糖含量的变化从侧面反映了发酵进程。对发酵过程各组发酵液残糖量的检测可以看出（图2），由于酵母菌不断生长繁殖，消耗大量的糖从而产生酒精，发酵液中糖含量先快速下降，之后随着发酵的完成保持缓慢变化。超声组的发酵进程相比对照组提前40 h完成发酵。这一变化趋势与发酵液中酵母菌活菌数的变化趋势相吻合，这也进一步证明了超声波处理能够促进细胞的快速增长。

图1　超声波对发酵液酵母菌数量的影响

图2　超声波对发酵液残糖量的影响

2.3超声波对发酵液中酒精浓度的影响

对发酵液酒精浓度的检测可以看出（图3），随着酵母菌不断发酵消耗糖，两组发酵液中酒精含量也在不断升高。超声组发酵液酒精浓度相比对照组提前20 h，在70 h达到最大浓度4.5 g/L。在30 h内酒精浓度会快速升高，发酵50 h后酒精浓度基本不再变化，而对照组的酒精浓度直到4 d后都在缓慢的升高。最终的超声组酒精浓度要高于普通组。在酵母发酵后期，往往会由于生成较大的酒精浓度而抑制发酵进程。在超声组中，酵母在较高的乙醇含量中快速地完成了发酵。

2.4超声波对发酵液黏度的影响

从表1可以看出，随着发酵进程的延续，酵母菌不断生长繁殖，消耗发酵底物导致发酵液黏度逐渐降低。发酵后、末期黏度基本不再变化，超声组发酵液黏度明显低于对照组，一方面是由于超声波处理加快酵母细菌的繁殖，促使发酵底物的利用，导致发酵液黏度降低，另一方面，超声波处理促使水分子团变小进一步导致黏度降低，这一规律与超声波处理可使水分子团变小、加快酵母生长的研究结果相一致。

图3　超声波对发酵液酒精浓度的影响

表1　超声波对发酵液黏度的影响

2.5超声波对发酵液水分子团的影响

通常情况下，水分子团簇是随机、无定形的无规线团，而水的物理化学性质，比如黏度、溶解能力、渗透力等都由其分子团簇结构决定。目前，核磁共振波谱（NMR）是直接测试分子团簇结构的主要手段［19］。17ONMR半峰宽可以定性表征水分子团簇大小，半峰宽越大水分子团簇也越大。由表2可以看出，发酵初期对照组和超声组发酵液水分子团17O半峰宽大小均为110 Hz，随着发酵的进行，两组水分子团大小均有减少，说明酵母发酵能够使水分子团变小，但对照组减小的幅度没有超声组明显，这也验证了超声波处理可以进一步打破水分子团，使之重新聚合成小分子团。水分子团越小，活性越大，水的溶解力、渗透力、代谢力、扩散力、乳化力均有所增强，而具有一定的“活化”作用，从一定程度上增强生物机体的新陈代谢能够促进生命活力［10］，对细胞膜孔有比较好的渗透力，能够很快渗入酵母细胞内，从而促进酵母细胞的生长。

表2　超声波对发酵液水分子团的影响

2.6超声波对酵母细胞表面变化的影响

从图4可以看出，对照组的酵母细胞表面形体饱满，没有大的凹陷。相反，超声组酵母细胞形体发生变化，不再饱满圆润，表面粗糙，出现一定程度的凹陷。这是由于超声波处理可以造成细胞表面微伤，使细胞壁局部破裂，在一定程度上改变细胞膜的通透性，从而加速了胞内物质的流出和胞外物质的流入，进而加快了发酵的进程。这一研究结果与戴传云等［20］和冯若等［21-22］的研究相一致，研究发现：低功率超声波可以导致细胞的非热生物效应，使细胞短时局部破裂而没有破碎、死亡，说明它在不影响代谢反应速度的情况下，对细胞表面造成微小损伤，它可以很容易地被细胞自身所修复。

图4　不同组酵母细胞表面

3　结论与展望

低强度的超声波处理可以有效地促进酵母细胞生长，加速酿酒酵母的发酵过程。本研究所选用的酿酒酵母在28℃的条件下，设置超声密度为50 W/L，超声频率为20 kHz，超声时间1 h，发现酵母细胞的菌落总数迅速增加，与对照组相比，大约提前18 h达到最大菌落数，发酵后期2组酵母菌落数基本一致；超声组与对照组相比，发酵过程提前40 h完成，酒精的最终产生量基本一致；同时研究发现，超声波处理还能够降低发酵液的黏度，减小水分子团簇，改变酵母菌细胞的形态，这些都有助于探究超声波处理加速酒精发酵的机理。

目前，我国食品加工的总体水平还有待提高，新工艺和新技术的研究与推广必将推动我国现有食品加工技术的进步。将超声波应用于食品工业，不仅技术简单，易于实现，而且减少了设备的投入，因此它在发酵工程领域的应用前景是十分广阔［23］。本研究为超声波处理技术在生物发酵工艺方面的应用提供了理论依据，但是对于超声ih促进酒精发酵的机制研究还未很透彻，需要进一步的研究。

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优先数字出版时间：2016-05-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160503.1410.008.html。

中图分类号：TS264；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0023-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016083

基金项目：国家863计划：（2013AA102203）；江苏省科技支撑项目（BE2013404）；镇江市农业科技支撑项目（NY2012013）。

收稿日期：2016-03-10

作者简介：王振斌（1975），男，陕西咸阳人，博士，教授，主要研究方向：食品物理加工技术。

Ultrasound-Assisted Alcohol Fermentation Technology

WANG Zhenbin，LIU Fengye，MAHaile，WANG Lin，ZHANG Cunsheng，YAN Jingkun and LIU Jiayou
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China）

Abstract:In order to promote the development of liquor-making technology，the mechanism of ultrasonic treatment to advance alcohol fermentation was explored.Based on the change in yeast amount，residual sugar content in fermenting liquid，ethanol yield，and fermenting liquid viscosity before and after ultrasonic treatment，the surface features and water clusters of yeasts before and after ultrasonic treatment were studied by SEM and NMR.The results showed that，in control group，yeast amount and alcohol content reached up to 2.86×108cfu/mL at 42 h and 4.5 g/L at 90 h respectively，fermenting liquid viscosity reduced gradually，the surface of yeast was well-stacked with no defect and no big sag，and17O half-peak breadth of water clusters was 85.39 Hz；in ultrasonic treatment group，yeast amount reached up to the maximum number of 2.75×108cfu/mL 18 hours in advance，and the consumption rate of reducing sugar and ethanol yield significantly increased，fermenting liquid viscosity was evidently lower than that in the control group，and the surface of yeast was rough and with big sag on the surface，and17O halfpeak breadth of water clusters was 54.32 Hz.This study provided a theoretical evidence for the application of ultrasonic treatment in biological fermentation.

Key words:alcohol fermentation；ultrasonic treatment；fermentation speed；mechanism