浓酱兼香型白酒不同储存期的高温大曲微生物群落结构与发酵特征分析

梁丽文，缪礼鸿，杨团元，张明春，刘蒲临，王　霜

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023； 2.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北松滋434200）

浓酱兼香型白酒不同储存期的高温大曲微生物群落结构与发酵特征分析

梁丽文1，缪礼鸿1，杨团元2，张明春2，刘蒲临1，王霜1

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023； 2.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北松滋434200）

摘要：选取白云边酒不同储存期的高温大曲为研究对象，从微生物数量、细菌种类、发酵力和糖化力等方面的变化规律进行分析。结果表明，在120 d的储存期内，随着时间的延长高温大曲细菌种类和数量以及霉菌的数量逐渐上升；大曲的发酵力整体呈缓慢上升的趋势，而糖化力先增加后降低。Bacillus.methylotrophicus在大曲中分布最广。大曲微生物数量与酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯的含量呈一定正相关。

关键词：浓酱兼香型白酒高温大曲； 储存期； 微生物群落结构； 发酵特征

白云边酒高温大曲是一种经过自然接种、高温发酵而制成的菌酶合一的糖化发酵剂［1］。酒曲中微生物的种类、数量、产酶特性在一定程度上决定着酒曲质量及其活性指标［2］。李丹宇等［3］发现在制曲过程中，糖化力、液化力、蛋白分解力与真菌数量和种类呈正相关，说明真核微生物对大曲生化酶类的生成有重要作用；总酸含量、蛋白分解力与细菌多样性呈显著相关。高温大曲发酵好后需经3个月左右的储存后才能使用。刘建文等［4］发现储存3～4个月的大曲，其纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均达到最好状态。大曲储存期越长，越容易导致曲虫危害，增加损耗和库存成本。因此，缩短大曲的储存期具有重要经济价值。

浓酱兼香型白云边酒大曲生产采用酱香型白酒高温制曲工艺［5］。本研究对不同储存期白云边酒高温大曲的微生物群落结构、理化性质与发酵特征进行了分析，旨在解析高温大曲在储存过程中的变化规律及微生物与发酵特性之间的关系，为合理设定大曲储存时间及进一步研究如何缩短大曲储存期提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

样品：不同储存期的高温单块大曲，混合大曲曲粉以及高粱，均由湖北白云边酒业股份有限公司提供。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌30 min。

马丁-孟加拉红培养基［6］。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母抽提物5.0 g，氯化钠10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌30 min。

主要试剂：细菌菌株DNA提取所需酶、Marker、dNTPs、Buffer等购于生工生物上海股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1样品的处理方法

取不同储存期的高温单块大曲粉碎，混合均匀并过20目筛后备用。

1.2.2菌株分离及计数方法

称取大曲曲粉样品10.0 g，加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，170 r/min摇床15 min，采用稀释涂布平板法［6］依次涂布于马丁孟加拉红平板，牛肉膏蛋白胨平板。马丁孟加拉红平板置于生化培养箱中以30℃培养2 d，观察，计数。牛肉膏蛋白胨平板置于生化培养箱中以37℃培养2 d，观察，计数，然后从平板上挑取数量上占优势且形态有差异的细菌菌落，经划线分离纯化、镜检，编号后保存备用。

1.2.3理化指标及测定方法

水分的测定：称取待测大曲曲粉样品3.0 g，用快速水分测定仪测定；发酵力的测定［7］：采用CO2失重法；糖化力的测定［7］：斐林试剂法。

1.2.4实验室模拟大曲白酒固态发酵方法

（1）焖高粱1.5 h。水温大于90℃，每浇淋1次后焖高粱30 min，共3次，焖高粱时盖紧锅盖。

（2）蒸高粱90～120 min。含水量控制在55%，然后冷却至25℃左右。

（3）将大曲以10%（质量比）的比例添加到摊凉的高粱中，混合均匀。

（4）将混合均匀的原料堆积后置于大塑料袋中，每个塑料袋约600 g，再置于37℃培养箱培养24 h，提高温度至42℃培养12 h，再升温至50℃培养12 h。分装于菌种瓶中，装满后用8层保鲜袋封口，并做好标记。

（5）置于28℃恒温恒湿培养箱中发酵，每隔7 d后取1瓶，即为酒醅。取部分酒醅蒸馏并进行气相色谱分析。

蒸馏方法：取50.0 g酒醅，加入150 mL的蒸馏水，蒸出100 mL的蒸馏液，过滤后采用气相色谱测定乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的含量。

1.2.5乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的测定方法

采用气相色谱测定法：气相色谱安捷伦5890A。载气流速25 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速400 mL/min，分流比20∶1。起始柱温为60℃，保持5 min，然后以10℃/min程序升温至160℃，保持5 min。

1.2.6细菌DNA的提取

将分离到的细菌菌株在牛肉膏蛋白胨平板上多次活化，并划线纯化后接种到LB液体培养基中，于37℃、170 r/min下摇床培养14 h，用细菌基因组试剂盒提取基因组DNA，检测后于-20℃保存备用。

1.2.7提取的细菌DNA的PCR扩增、分子测序和系统发育树构建

细菌DNA采取试剂盒抽提后，PCR扩增16S rDNA，细菌的16S rDNA引物为27F和1492R。反应体系采用50 μL的反应体系。PCR循环程序为：94℃预变性5 min，94℃50 s，54℃50 s，72℃90 s，循环30次；72℃延伸10 min。扩增的细菌PCR产物送金唯智生物科技有限公司测序，测序长度在1400 bp左右，测序结果采用BioaEdit软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16S rDNA序列区序列，用MEGA软件采取邻接法构建系统发育树。

表1　不同储存期的高温单块大曲理化指标及微生物数量分析结果

2　结果和分析

2.1不同储存期的高温单块大曲理化指标及微生物数量分析结果

不同储存期的浓酱兼香型白云边酒高温单块大曲理化指标及微生物数量分析结果见表1。

由表1可知，储存时间对大曲的含水率影响不大，其都在10%上下波动。大曲糖化力先升后降，在储存120 d时达到最大值，与此同时霉菌数量也在120 d内逐步上升达到最高后下降，表明在120 d储存期内大曲的糖化力与霉菌的数量之间具有明显的正相关性。大曲的发酵力在整个储存期内有所波动，但幅度不大，总体上呈缓慢上升趋势，这与细菌和霉菌数量的变化不一致，表明高温大曲的发酵力与细菌和霉菌数量之间没有明显的相关性。

由于同一储存期的每块大曲间存在一定波动性，因此选取了2个时间段的大曲粉碎车间的混合大曲曲粉进行进一步分析。不同储存期的浓酱兼香型白云边酒高温混合大曲曲粉理化指标及微生物数量分析结果见表2。

表2　不同储存期的高温混合大曲曲粉理化指标及微生物数量分析结果

表2的数据显示，细菌数和霉菌数量较高的120 d曲粉，发酵力和糖化力也高于30 d的曲粉，这与单个曲块的测定的结果一致，表明单块取样虽然存在差异性，但仍可在一定程度上反映其大体变化趋势。总体来说，储存120 d的大曲发酵力和糖化力最强，适合生产白酒。

2.2不同储存时间高温单块大曲的细菌种类分离鉴定

经稀释涂布平板法和划线分离纯化法，从不同储存期的大曲曲块中共分离得到10株优势细菌。其系统发育树如图1。这10株细菌分别与GenBank中1个属的7种模式菌株的序列相似度均≥99%，分别为Bacillus licheniformis、Bacillus sp.、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus tequilensis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus methylotrophicus。不同储存期大曲中细菌的种类见表3。

图1　10株细菌基于16S rDNA基因序列的系统发育树

表3　不同储存期的高温单块大曲中细菌的种类

表3的数据显示，不同储存期曲块的细菌种类差异比较大。细菌的种类由储存期0 d大曲的1种增加到120 d的5种又降至180 d的1种。从整体趋势上看，随着时间的延长，细菌种类先逐渐增加，之后趋于单一。分离得到的细菌均为芽孢杆菌属，其中，B.methylotrophicus为甲基营养型芽孢杆菌，存在于每种不同储存期的大曲样品中，是绝对的优势菌株。

2.3不同储存期大曲的实验室模拟固态白酒堆积发酵结果

2.3.1储存60 d和195 d的单块大曲实验室模拟固态白酒发酵结果

储存60 d和195 d的大曲实验室模拟固态白酒发酵酒醅中酒精度和正丙醇含量结果比较见图2—图4。

图2　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中酒精度的变化比较

图3　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中正丙醇含量的变化比较

图4　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中乙酸乙酯含量的变化比较

由图2数据看出，在装瓶发酵23 d后，添加195 d大曲的酒醅中酒精含量高于添加60 d大曲的酒醅。这一结果与2.1中对大曲的发酵力测定结果相一致。由图3和图4数据可知，在装瓶发酵的不同时间段，添加195 d大曲的酒醅中正丙醇和乙酸乙酯的含量高于添加60 d大曲的酒醅。

2.3.2储存30 d和120 d的混合大曲曲粉实验室模拟固态白酒发酵结果

储存30 d的混合大曲曲粉和120 d的混合大曲曲粉实验室模拟固态白酒发酵酒醅中微生物数量比较见表4。

表4　不同储存期的混合大曲曲粉实验室模拟固态白酒酒醅中微生物数量比较

由表4数据可知，在堆积结束后，酒醅中已检测到较多酵母菌，所添加的曲粉中却未检测到酵母菌，证实了白酒酿造过程中酵母菌来源于空气、原料和工厂车间这一结论。堆积结束后添加120 d曲粉酒醅中，酵母菌数量略低于30 d的曲粉，细菌数较高。到发酵30 d后，120 d曲粉酒醅中酵母菌数和细菌数均高于30 d的曲粉。

储存30 d和120 d的混合大曲曲粉实验室模拟固态白酒发酵酒醅中酒精度、正丙醇含量和乙酸乙酯含量结果比较见图5—图7。

图5　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中酒精度的变化比较

图6　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中正丙醇含量的变化比较

上述结果表明，储存120 d曲粉的发酵酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯浓度均高于储存30 d曲粉发酵的酒醅，而发酵结束后120 d曲粉的发酵酒醅中微生物数量也高于30 d曲粉发酵的酒醅，表明酒醅中酵母菌数量是出酒率和酒质的直接体现，这与刘俊超等［8］的结果相一致。

图7　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中乙酸乙酯含量的变化比较

3　讨论

本研究表明，在一定的有效储存期内，高温大曲细菌种类和数量及霉菌的数量不降反增，这一结果与张秀红等［9］报道的结果相似，而与大曲储存是减少产酸菌的数量的认知相反［7］。大曲的发酵力整体呈缓慢上升的趋势，与传统观念“大曲存储时间越长，发酵力越弱”不一致，推测可能与大曲中还存在其他未培养的微生物与发酵力有关。本研究从白云边不同储存期的各高温大曲样品中均能分离到B.methylotrophicus。游玲等［10］发现，B. methylotrophicus在酿造车间分布很广，其耐受乙醇及乙酸能力较好，并有报道［11］表明其可分解甲醇，可能有助于降低糟醅中的甲醇含量。该菌种在传统大曲酒酿造过程中的功能有待进一步研究。

本实验结果说明白云边高温大曲储存120 d的大曲在出酒率及产酯率方面均优于储存30 d的大曲，这与传统大曲酒厂普遍采用储存120 d左右的成曲进行大曲酒发酵的实践相一致。在120 d储存期内，随储存期的延长，霉菌的数量、糖化力均明显增加，从而提高了出酒率。这一结果与之前研究得出的白云边混合大曲的霉菌和酵母菌数量与其酒化力成正相关的结论相一致［12］。

从白云边高温大曲储存期的微生物数量及种类的结果分析来看，高温大曲发酵存在一个明显的后发酵期，即高温发酵期过后，随着大曲品温的下降，中温型的霉菌和细菌开始缓慢生长，导致糖化率明显增加。这种微生物种类及数量的增加可能是由于大曲自身的微生物进行恢复性生长，也可能是外来的曲房环境中的微生物在大曲表面生长引起的，其机理有待深入研究。

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优先数字出版时间：2016-05-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160512.1533.005.html【DOI】10.13746/j.njkj.2016。

中图分类号：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0037-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016084

基金项目：湖北省重大科技创新计划项目资助（2013ABA008）。

收稿日期：2016-03-10

作者简介：梁丽文（1991-），女，湖北仙桃市人，硕士研究生，E-mail：110liangliwen@sina.com。

通讯作者：缪礼鸿，教授。

Microbial Community Structure and Fermentation Characteristics of High-Temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu in Different Storage Periods

LIANG Liwen1，MIAO Lihong1，YANG Tuanyuan2，ZHANG Mingchun2，LIU Pulin1and WANG Shuang1
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023；2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.Ltd.，Songzi，Hubei 434200，China）

Abstract:In this study，high-temperature Daqu of Baiyunbian liquor in different storage periods was used as the research object.The change rules of microbes quantity，bacteria varieties，fermenting power and saccharifying power were summed up.The results suggested that，within 120 d storage period，bacterial varieties and quantity and mold quantity in high-temperature Daqu increased gradually with the storage time，the fermenting power of Daqu increased slowly，and the saccharifying power of Daqu increased at the beginning and then dropped.Bacillus methylotrophicus had the widest distribution in Daqu.And the quantity of microbes in Daqu was positively correlated with the content of ethanol，normal propyl alcohol and ethyl acetate in fermented grains.

Key words:high-temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu；storage time；microbial community structure；fermentation characteristics