正交法优化酱香型大曲类黑素提取工艺

徐　延，蒋英丽，程　伟，李维捷，孟资宽，高　鸿，罗爱民（.四川大学食品工程系，四川成都60064； .四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺6800）

正交法优化酱香型大曲类黑素提取工艺

徐延1，蒋英丽2，程伟2，李维捷1，孟资宽1，高鸿1，罗爱民1
（1.四川大学食品工程系，四川成都610064； 2.四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺618200）

摘要：为了优化提取酱香型大曲类黑素的工艺条件，采用L9（34）正交设计，以酱香型大曲为提取原料，以乙醇溶液为提取溶剂，以类黑素浓度为考察指标，研究了提取浓度、提取温度、液固比和提取时间等单因素对提取效果的影响。结果表明，提取浓度、提取温度、液固比和提取时间对类黑素终浓度的影响均达到显著水平，其影响程度为液固比＞提取浓度＞提取时间＞提取温度。确定酱香型大曲类黑素最佳提取条件为：提取温度70℃，提取浓度

40%，提取时间3 h，液固比17.5∶1。可作为深入研究酱香型大曲的基础。

关键词：大曲； 类黑素； 正交实验； 提取工艺

酱香型白酒是中国白酒的五大香型之一［1］，具有酱香突出、酒体醇厚、幽雅细腻、回味悠长的风格特点［2-4］，它独特的香型与其独特的酿造工艺有着密不可分的关系，其典型代表是贵州茅台酒和四川郎酒。酱香型白酒的特殊工艺之一是高温制曲［5］，因为酿酒生产中用曲量大，几乎与制酒原料高粱比为1∶1，曲的质量在一定程度上决定了酒质的优劣，故有“曲乃酒之骨”“好曲出好酒”的说法［6］。影响酱香型大曲质量的因素有很多，但主要在于制曲温度的高低［7］。在高温培养过程中，发生美拉德（Maillard）反应，由于制曲温度的不同，形成了3种不同颜色和风格的高温大曲：黑块曲、白块曲和黄块曲。黑块曲酱香突出并带有焦香，但糖化力低；白块曲糖化力较高但酱香味不足；黄块曲则各项指标较为适宜［8-9］。在生产中，黑块曲若用量少，则可使酒有愉快的焦香；若用量大，则成品酒糊苦味重，以致造成“焦盖酱”的后果，影响酒的风格和质量。因此各种风格的酒曲的配比对生产高质量的酒尤为关键。而实际应用中，制曲工人仅凭颜色来对曲块进行质量分级配比，而曲的颜色是渐进变化的，单纯的将曲分为黑、白、黄3类进行配比的方法较为粗犷。因此，为了实现生产用曲的精确配比，找到一种表征曲块质量的指标尤为重要，而类黑素是美拉德反应终产物，呈黑褐色，类黑素含量越高，颜色越深［10］。因此，可用曲块中类黑素含量来表征曲块颜色的深浅，进而来判断曲药的质量。本研究利用单因素及正交实验，确定了酱香型大曲类黑素的最优提取工艺，为进一步对大曲质量分级奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

酱香型大曲：采用四川省古蔺郎酒厂熟练工人挑选的颜色一致，断面颜色均一，发酵良好的生产用成品曲。成品曲打碎后再粉碎过60目筛，取筛下部分烘干至恒重装入密封袋备用。无水乙醇（分析纯，成都科龙化工试剂厂），实验用水为四川大学试剂科提供。

1.2仪器与设备

FW-100高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；JA1203上皿电子天平，上海精科天平；TDL-4013低速离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SpectraMax 190酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.3实验方法

1.3.1提取工艺流程

大曲粉→称重→在一定温度一定液固比下浸提→离心取上清液→旋转蒸发→定容→吸光度测定

1.3.2类黑素含量测定

将1.3.1中类黑素提取物用蒸馏水定容于50 mL的容量瓶中，以对应体积分数的乙醇溶液作空白液，在470 nm处测定其吸光度，用下面的公式计算类黑素浓度［11-12］。

C=A/eb

式中：C——类黑素的含量（mmol/L）；

A——样液的吸光度（470 nm）；

e——类黑素的摩尔消光系数0.64 L/mmol·cm；

b——比色皿厚度（cm）。

1.4单因素实验

按1.3.1节的提取工艺流程，在其他条件相同的情况下，进行单因素实验，分别研究不同乙醇溶液浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%），不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃），不同提取时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），不同液固比（7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1）（mL/g）对类黑素浓度的影响，用以确定正交实验的因素水平。

1.5正交实验

在单因素实验的基础上，以乙醇浓度、提取时间、液固比、提取温度作为影响因素，进行4因素3水平L9（34）的正交实验，通过正交实验确定类黑素的最佳提取工艺，因素水平编码表见表1。

1.6数据处理

表1　正交实验因素水平编码表

所有的实验均重复3次，结果以平均数表示，利用SPSS20.0统计软件对结果进行分析。

2　结果与分析

2.1提取温度对类黑素浓度的影响

称取4.000 g大曲粉，分别加入等体积的浓度为60%的乙醇水溶液50 mL，分别在30℃、40℃、50℃、60℃条件下水浴加热并不断搅拌，3 h后，离心取上清液，将其浓缩，再用50 mL容量瓶进行定容，于470 nm处测吸光度，考察不同提取温度对类黑素浓度的影响，结果见图1。

图1　不同提取温度对类黑素浓度的影响

由图1可以看出，随着提取温度的上升，类黑素浓度逐渐上升。用SPSS软件进行单因素分析，用Duncan法进行两两比较，取α=0.05时，sig＜0.01，组间差异极显著，提取温度对类黑素浓度的影响极显著。20℃、30℃、40℃、50℃、60℃间差异显著，各成一类子集。最终选择60℃作为提取温度的中间水平进行正交实验。

2.2乙醇浓度对类黑素终浓度的影响

称取4.000 g大曲粉，分别加入等体积的浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液50 mL，在60℃条件下水浴加热并不断搅拌，3 h后，离心取上清液，将其浓缩，再用50 mL容量瓶进行定容，测定在470 nm处吸光度，考察不同乙醇浓度溶液对类黑素浓度的影响，结果见图2。

由图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，类黑素浓度先上升后下降，当乙醇浓度为40%时达到最高点。用SPSS软件进行单因素分析，用Duncan法进行两两比较，取α=0.05时，sig＜0.01，组间差异极显著，乙醇浓度对类黑素浓度的影响极显著。50%、60%差异显著，各成一类子集；30%、40%间差异不显著，归为同类子集；70%、80%间差异不显著，归为同类子集。最终选择30%作为乙醇溶液浓度因素的中间水平进行正交实验。

2.3提取时间对类黑素浓度的影响

称取4.000 g大曲粉，分别加入等体积的浓度为60%的乙醇水溶液50 mL，在60℃条件下水浴加热并不断搅拌，分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后离心，取上清液，将其浓缩，再用50 mL容量瓶进行定容，测定在470 nm处吸光度，考察不同提取温度对类黑素浓度的影响，结果见图3。

图2　不同乙醇浓度对类黑素浓度的影响

图3　不同提取时间对类黑素浓度的影响

由图3可知，随着提取时间的延长，类黑素浓度逐渐升高至基本保持不变，提取时间为3 h时达到最高。3 h后基本保持不变，说明在提取3 h后，类黑素基本溶出完全。用SPSS软件进行单因素分析，用Duncan法进行两两比较，取α=0.05时，sig＜0.01，组间差异极显著，提取时间对类黑素浓度的影响极显著。1 h和2 h和3 h和4 h、5 h间差异显著，各成一类子集，其中4 h、5 h间差异不显著，归属同类子集。最终选择3 h作为提取时间因素的中间水平进行正交实验。

2.4液固比对类黑素浓度的影响

称取4.000 g大曲粉，分别按液固比为7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1（mL/g）加入相应体积的浓度为60%的乙醇水溶液，在60℃条件下水浴加热并不断搅拌，3 h后，离心取上清液，将其浓缩，再用50 mL容量瓶进行定容，测定在470 nm处吸光度，考察不同液固比对类黑素浓度的影响，结果见图4。

图4　不同液固比对类黑素浓度的影响

由图4可知，随着单位质量提取溶液体积增加，类黑素浓度先升高再下降，在液固比为15∶1（mL/g）时达到最高。用SPSS进行单因素分析，用Duncan法进行两两比较，取α=0.05时，sig＜0.01，组间差异极显著，表明液固比对类黑素浓度的影响极显著。7.5∶1和10∶1和12.5∶1、15∶1和17.5∶1和20∶1（mL/g）间差异显著，各成一类子集。最终选择15∶1（mL/g）作为液固比因素中间水平进行正交实验。

2.5正交实验设计与优化

按1.6节方案进行正交实验。正交实验设计及直观分析结果见表2。

表2　正交实验设计及结果分析

由表2可知，在影响类黑素浓度的提取温度、乙醇浓度、提取时间和液固比这4个因素中，影响大小的次序为液固比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度。从表2中可选择的最优组合为A3B3C2D3，与用SPSS软件分析得出的结果一致，即优选的组合条件为：提取温度70℃，乙醇浓度40%，提取时间3 h、液固比17.5∶1（mL/g）。用优化后的条件进行验证实验，最终类黑素浓度达到3.01 mmol/L，高于正交实验的任一实验组，表明优化后的组合条件是可用于后续的大批量提取的。

3　结论

本研究通过单因素及正交实验，确定了酱香型大曲中类黑素提取的最优工艺条件。得到的最优工艺条件为：提取温度70℃，乙醇浓度40%，提取时间3 h以及液固比17.5∶1（mL/g）。在此条件下从酱香型大曲中提取得到的类黑素浓度最高。目前关于大曲质量分级的研究较为少见，本研究找到一种能够表征大曲质量的指标，为后续的酱香型大曲的质量分级奠定了基础，关于酱香型大曲质量分级的深入研究有待进行。

美拉德反应属于非酶促褐变反应［13］，世界上比较公认的美拉德反应机理是由Hodge提出的［14］，美拉德反应的产物结构复杂，种类繁多，现今研究得较多也较清楚的是糖基化最终产物和类黑素［15］。类黑素是指碳水化合物（一般指糖类）与带有自由氨基的含氮化合物（如氨基酸、肽、蛋白质等）之间发生美拉德反应后期形成的一种棕褐色物质，它是由多种结构和不同分子量的多种物质组成的复杂混合物，而且褐变的原料以及反应条件均是类黑素组成的影响因素［16］。目前，人们对食品颜色的形成机理还不完全了解，而对类黑素的结构更是知之甚少。因此，不同原料里类黑素的结构不尽相同，找到酱香型大曲类黑素的最佳提取工艺尤为关键，从酱香型大曲中提取出的类黑素可做进一步的深入研究，包括类黑素的理化性质、成分组成等。

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优先数字出版时间：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1423.011.html。

中图分类号：TS262.3；TQ925.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）07-0051-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016045

基金项目：白酒质量安全可追溯系统的发展现状对策研究（2015ZR0181）。

收稿日期：2016-02-18

作者简介：徐延，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail：xy7217@126.com。

通讯作者：罗爱民。

Optimization of the Extraction Technology of Melanoidins from Jiangxiang Daqu by Orthogonal Test

XU Yan1，JIANG Yingli2，CHENG Wei2，LI Weijie1，MENG Zikuan1，GAO Hong1and LUOAimin1
（1.Department of Food Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610064；2.Langjiu Group Co.Ltd.，Gulin，Sichuan 618200，China）

Abstract:To optimize the extraction technology of melanoidins from Jiangxiang Daqu，L9（34）orthogonal design was adopted with Jiangxiang Daqu as the extracting material and ethanol solution as the extracting solvent.The effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were investigated through single factor experiment.The results showed that，the effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were significant，and their influencing degree ranked in decreasing sequence as liquid solid ratio＞ethanol solution concentration＞extraction time＞extraction temperature.The optimium extracting parameters of malanoidins from Jiangxiang Daqu were summed up as follows:extraction temperature was at 70℃，ethanol solution concentration was 40%，extraction time was 3 h，and liquid-solid ratio was 17.5∶1.

Key words:Daqu；melanoidins；orthogonal experiment；extraction technology