维生素A对鸡慢性呼吸道病脂质过氧化及抗氧化系统的影响

梁 燕，翟金武，林安壮

(1.贵州省安顺市动物疫病预防控制中心，贵州 安顺 561000;2.贵州省安顺学院，贵州 安顺 561000;3.贵州省安顺市吉鸿农业生态开发有限公司，贵州 安顺 561000)

维生素A对鸡慢性呼吸道病脂质过氧化及抗氧化系统的影响

梁 燕1，翟金武2，林安壮3

(1.贵州省安顺市动物疫病预防控制中心，贵州 安顺 561000;2.贵州省安顺学院，贵州 安顺 561000;3.贵州省安顺市吉鸿农业生态开发有限公司，贵州 安顺 561000)

目的:研究维生素A对人工感染鸡毒支原体病脂质过氧化及抗氧化系统的影响，探讨维生素A辅助治疗鸡慢性呼吸道病的作用机制，并提出合理治疗剂量。方法:采用人工感染诱发鸡慢性呼吸道病建立病理模型，在对因治疗选择泰乐菌素的基础上，联合运用不同剂量的维生素A作为辅助治疗，观察支气管、肺组织病理变化，检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量指标。结果:药物治疗鸡慢性呼吸道病后，各治疗组气管、肺组织损伤都有不同程度减轻，以维生素A中、高剂量组改善最为明显;各治疗组SOD值、MDA值不同程度恢复，以维生素A中剂量组最为显著，与健康对照组比较差异不显著(P＞0.05)。结论:维生素A可以通过抑制机体脂质过氧化反应，提高机体清除自由基能力的作用，保护呼吸系统免受过氧化物的损伤，加速肺受损组织修复，对鸡慢性呼吸道病起到良好的辅助治疗效果，以剂量为1 200 IU/kg饲料效果最佳。

维生素A;鸡慢性呼吸道病;脂质过氧化;抗氧化系统

鸡慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease，CRD)是由鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum，MG)引起的鸡和火鸡的一种慢性呼吸道传染病。研究发现［1，2］，CRD 的发生发展除 MG 病原直接破坏宿主细胞、影响机体免疫调节外，还与机体氧化/抗氧化状态关系密切。MG感染呼吸道后，借助黏附分子吸附于呼吸道黏膜上皮细胞壁的神经氨酸酶受体，释放出过氧化物，破坏机体氧化∕抗氧化平衡。维生素A的抗氧化作用已被证实，相关报道也较多［3～5］，但关于维生素A辅助治疗CRD的相关研究较少，主要限于临床使用，并没有深入研究其作用机制，而且临床治疗剂量存在差异较大，不能为合理治疗剂量的制定提供科学参考意义。

本研究拟用人工感染鸡毒支原体，在对因治疗选择泰乐菌素的基础上，使用不同剂量的维生素A辅助治疗人工感染鸡毒支原体，通过观察气管、肺组织病理变化及血清MDA和SOD值的动态变化，探讨维生素A对人工感染鸡慢性呼吸道病脂质过氧化及抗氧化系统的影响，为维生素A治疗CRD的研究和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 标准菌株:鸡败血霉形体(MGPG31)冻干株(批号:20011114)，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 试验药品及试剂:维生素A(厦门星鲨制药有限公司生产，25 000 IU/粒，批号:10111001);磷酸泰乐菌素(四川省川龙动科药业有限公司生产，每毫克含泰乐菌素805 IU，批号:106728B);鸡毒支原体平板凝集抗原(批号:201401)、鸡毒支原体阳性血清(批号:20131218)均购自中国兽医药品监察所;SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号:20140601，20140615)

1.1.3 试验动物:1日龄艾维茵鸡200羽，雌雄各半(购于清镇温氏畜牧有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡慢性呼吸道病模型的建立及判断

1.2.1.1 鸡慢性呼吸道病模型的建立 :将1日龄艾维茵鸡(200羽，雌雄各半)，用不含任何抗菌素药物的全价饲料饲养至2周龄，实验前按10%比例抽血作快速平板凝集反应检查，MG抗体阴性。随机选取170只鸡通过左胸气囊注入107cfu/mL鸡毒支原体强度培养物0.3 mL(配合点眼、滴鼻0.3 mL)。剩余30只作为健康对照组(Ⅰ组)，注射物以无菌生理盐水代替。

1.2.1.2 鸡慢性呼吸道病模型的的判定:主要依据临床典型症状、病理学变化和血清学检查进行鸡实验性慢性呼吸道病模型的判定。试验鸡接种MG培养液7 d后，出现呼吸道症状:咳嗽，甩头，打喷嚏，呼吸啰音。按20%比例抽血作平板凝集反应检查，阳性率≥5%。对死亡和症状明显鸡(随机选取5只)进行剖检，观察病理变化:出现气管黏膜充血，肺脏充血，气囊壁混浊，肝肿大，心外膜有纤维蛋白渗出等典型病理变化。将气管、肺做病理切片进行组织学病理观察发现:气管纤毛上皮增生，黏膜下层有淋巴细胞、红细胞浸润，黏膜腺体增生;肺部组织结构紊乱，支气管、肺房及肺毛细管腔内弥散大量的红细胞、淋巴细胞;支气管黏膜上皮的纤毛部分脱落，肺泡隔增厚等。以上检查结果皆符合鸡慢性呼吸道病发病症状及病理变化，证明病理模型建立成功。

1.2.2 试验动物分组及给药:模型建立成功后，挑选具有典型症状的感染鸡150羽随机分为5组，每组30只，分别为模型组(Ⅱ组)、泰乐菌素组(Ⅲ组)、维生素A低剂量+泰乐菌素组(Ⅳ组)、维生素A中剂量+泰乐菌素组(Ⅴ组)、维生素A高剂量+泰乐菌素组(Ⅵ组)。试验处理见表1。维生素A拌料时以大豆油(100 mL)为溶媒剂，其余各组用相同剂量大豆油拌料;泰乐菌素饮水给药;每天给药1次，连续给药7 d。

表1 试验鸡分组及处理

1.2.3 样品的采集:分别于第 1、3、5、7 d 给药12 h后，每组随机抽取5只鸡翅静脉采血10 mL，以3 000 r/min离心10 min分离血清，放入－20℃冰箱，测定血清抗氧化指标。并在最后1次采血结束，快速处死试验鸡，剖检迅速取出肺脏及支气管、左右主支气管分叉以上约5 mm的气管，用冷生理盐水洗净残血，吸干水分，置于10%多聚甲醛中固定。

1.3 指标检测

1.3.1 血清学测定:分别采用硫代巴比妥酸法测定MDA和黄嘌呤氧化酶法测定SOD，严格按照说明书流程操作。

1.3.2 病理学检查:常规制备石蜡切片，乙醇梯度脱水，HE染色，光镜下观察气管、肺组织病理变化。

2 结果与分析

2.1 气管、肺组织病理学检查 Ⅰ组气管组织结构基本正常，肺泡结构清晰，肺泡腔内未见水肿液，肺泡隔正常，间隔无水肿液。Ⅱ组见气管壁淋巴细胞、浆细胞浸润，黏膜上皮纤毛倒伏、粘连或脱落，杯状细胞明显增多、胞体增大;肺组织结构紊乱，肺泡腔内有大量的粉红色炎性蛋白和水肿液，肺间质中度淋巴细胞浸润，肺泡隔中度增宽，伴有淋巴细胞浸润，红细胞渗出较多，肺毛细管数量减少。见图1～4。

图1 Ⅰ组气管组织(HE400×)

图2 Ⅱ组气管组织(HE400×)

图3 Ⅰ组肺组织(HE400×)

图4 Ⅱ组肺组织(HE400×)

给予不同药物治疗后，与Ⅱ组比较，各治疗组病理变化不同程度减轻。Ⅲ组:气管及肺内支气管复层上皮中黏液细胞多，管腔内有少量浆液和红细胞;肺间质淋巴细胞中至轻度浸润，肺泡隔中度增宽;肺泡腔红细胞渗出较轻。Ⅳ组:呼吸道为假复层上皮，黏液细胞多，脱落上皮和间质淋巴细胞浸润较少;肺泡隔中度增宽，淋巴细胞浸润和渗血略有减轻。Ⅴ、Ⅵ组肺部病变改善最为明显，呼吸道黏膜为假复层上皮，黏液细胞较少;管壁间质淋巴细胞浸润减轻，局部淋巴细胞聚集成团;肺泡隔轻度增宽，红细胞、淋巴细胞渗出少，肺毛细管数增加，但与Ⅰ组比较肺组织结构并未恢复至健康水平。见图5～12。

图5 Ⅲ组气管组织(HE400×)

图6 Ⅳ组气管组织(HE400×)

图7 Ⅴ组气管组织(HE400×)

图8 Ⅵ组气管组织(HE400×)

图9 Ⅲ组肺组织(HE400×)

图10 Ⅳ组肺组织(HE400×)

图11 Ⅴ组肺组织(HE400×)

图12 Ⅵ组肺组织(HE400×)

2.2 SOD、MDA的变化 分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测得SOD值和MDA值，见表2、表3。

由表2可知，在治疗过程中，Ⅱ 组MDA值一直持续升高，与Ⅰ组差异极显著(P＜0.01);第1 d给药12 h后，各治疗组MDA值均无降低趋势，与Ⅱ 组差异不显著(P＞0.05);第3 d给药12 h后，各治疗组MDA值不同程度降低，与 Ⅱ 组差异极显著(P＜0.01);第5 d给药12 h后，各治疗组中Ⅴ组下降幅度最大，与Ⅰ组差异不显著(P＞0.05);第7 d给药12 h后，Ⅴ组MDA值恢复至正常健康水平，与Ⅰ组无显著差异(P＞0.05)，其余各治疗组MDA值虽然有降低，但仍与Ⅰ组存在极显著差异(P ＜0.01)。

表2 治疗期间各组MDA值(nmol/mL)

表3 治疗期间各组SOD值(U/mL)

由表3可知，在治疗过程中，Ⅱ组SOD值一直持续下降，与Ⅰ组差异极显著(P＜0.01);第1 d给药12 h后，各治疗组SOD值均无显著改善，与Ⅱ组差异不显著(P＞0.05);第3 d给药12 h后，各治疗组中 Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 组上升水平较快，与Ⅱ组差异极显著(P＜0.01)，Ⅲ组上升水平相对较慢，与Ⅱ组差异不显著(P＞0.05);第5 d给药12 h后，各治疗组SOD值继续上升，Ⅳ、Ⅴ组改善最为明显;第7 d给药12 h后，Ⅳ、Ⅴ组SOD值恢复至正常健康水平，与Ⅰ组无显著差异(P＞0.05)，其余各治疗组SOD值虽然有升高，但仍与Ⅰ组存在极显著差异(P ＜0.01)。

3 讨论

3.1 自由基是由机体有氧代谢中约2%的氧转变而成，在生理情况下机体自由基的产生与清除处于平衡状态，失衡时即出现脂质过氧化。在机体清除自由基过程中，存在两个体系，即非酶体系维生素A、维生素E和维生素C等抗氧化的小分子及抗氧化酶如氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH －PX)、过氧化氢酶(CAT)等。其中SOD具有重要作用，可歧化超氧阴离子为H2O2和O2，终止自由基的链锁反应，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是自由基使生物膜中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应而形成的脂质过氧化产物，其含量可以反映脂质过氧化作用的程度，间接反映出体内细胞受自由基攻击的程度。

3.1.1 本试验通过观察血清SOD、MDA含量变化发现，感染MG后，模型组MDA值随着病程的加长持续升高，SOD值持续降低，与健康对照组差异极显著(P ＜0.01)，这与彭运生［6］、陈志刚［7］等报道支原体肺炎MDA值水平上升、SOD值水平下降结果一致，提示CRD存在氧化－抗氧化系统失衡。正常情况下，肺具有有效的氧自由基清除系统，使其产生和清除处于平衡状态。但当机体遭受氧化应激、微生物入侵时，体内产生大量自由基，脂质过氧化反应增强，致使其反应产物MDA增多;而自由基又使各种免疫效应细胞的集聚和激活［8，9］，加重肺部炎症反应，使得机体抵抗力降低，抗氧化系统功能的减弱，不能产生足够的SOD，从而MDA含量增多 SOD含量减少，导致SOD/MDA失衡。

3.1.2 给予不同药物治疗后，各组SOD、MDA值都有不同程度的变化，说明泰乐菌素作为基础治疗药物，对MG有较好的抑菌作用，一定程度上控制病情的恶化。各治疗组血清MDA值不同程度降低，其中泰乐菌素组MDA水平降低12.9%，维生素A低、中、高剂量组MDA水平分别降低17.8%、33.2%、13.4%，维生素A中剂量组MDA值恢复至正常健康水平，与健康对照组差异不显著(P＞0.05)，说明维生素A可以降低脂质过氧化程度，本试验中以治疗量1 200 IU/kg饲料效果最佳。各治疗组血清SOD值不同程度升高，其中泰乐菌素组SOD水平增加28.0%，维生素A低、中、高剂量组SOD水平分别增加40.1%、42.4%、29.5%，维生素 A 低、中剂量组SOD值恢复至正常健康水平，与健康对照组差异不显著(P＞0.05)，说明维生素A可以提高机体清除自由基能力，本次试验中以治疗量1 200 IU/kg饲料最为显著。

3.2 本试验通过观察气管、肺组织病理学变化发现，感染MG后，模型组气管、肺组织出血严重，炎症反应明显，且伴有肺部浆液渗出和间质细胞增生，其病理损伤的严重程度与MDA含量的变化程度呈正相关。由于MG导致氧化－抗氧化系统失衡，各种致炎因子和氧化物质表达增多引起机体大量有害自由基积累，随着病情的进展，氧自由基可进一步使脂质过氧化，其终产物MDA水平上升，引起蛋白质交联变性，DNA断裂，细胞膜损伤，破坏肺组织结构［10，11］。给予药物治疗后，各组除临床症状有所改善，气管、肺组织中炎性细胞浸润减轻，其中维生素A高、中、低剂量组还表现出肺组织出血，渗出减轻，肺组织结构趋于正常，且随着维生素A治疗剂量的增加，其作用逾明显。进一步说明维生素A作为生物抗氧化剂，可抑制脂质过氧化反应，抵抗自由基损伤，修复自由基损失所致膜结构、DNA、蛋白质的破坏，改善肺组织病变，保护细胞结构和功能的完整性。

3.3 本试验同时发现，虽然随着维生素A治疗剂量的增加，肺组织的保护与修复作用逾明显，但SOD、MDA值并没有成线性关系变化，维生素A中剂量比高剂量能更大程度升高血清SOD值，降低MDA值。已有研究证实维生素A供应过量时，不但不能发挥正常的生理作用，还可能对机体产生不利影响。任国锋等［12］报道，高剂量的维生素 A对大鼠不仅无抗氧化作用，反而产生毒害作用。夏兆飞等［13］研究发现，大剂量维生素A能够降低鸡肝和脑的GSH－Px和SOD的活力，危害抗氧化防御系统。本次试验结果显示，维生素A中剂量(1 200 IU/kg)能显著升高SOD值、降低MDA值，有效保护呼吸系统完整性，促进疾病恢复。根据美国NRC的营养需要量标准:肉用鸡和蛋用种苗鸡的维生素A需要量为1 500 IU/kg饲料，产蛋鸡和种鸡为4 000 IU/kg饲料。最适添加量为需要量的2～3倍，治疗剂量为需要量的5～10倍，中毒剂量是需要量的10～20倍。本试验维生素A低、中、高剂量组添加剂量分别为600、1 200、1 800 IU/kg饲料，都属于正常治疗剂量范畴，实验结果具有参考意义。

综上所述，维生素A可以通过抑制机体脂质过氧化反应，提高机体清除自由基能力的作用，保护呼吸系统免受过氧化物的损伤，加速肺受损组织修复，对鸡慢性呼吸道病起到良好的辅助治疗效果，并以剂量为1 200 IU/kg饲料效果最佳。

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The Influence of Vitamin A on Lipid Peroxidation and Antioxidation System on Chronic Respiratory Disease

Liang Yan1，Zhai Jinwu2，Lin Anzhuang3

(1.Animal Disease Prevention and Control Center in Anshun City of Guizhou Province，Anshun Guizhou 561000，China;2.Anshun College ，Anshun Guizhou 561000，China;3.Ji－Hong Agriculture Ecological Development co.，LTD in Anshun City of Guizhou Province，Anshun Guizhou 561000 ，China)

To investigate the influence of Vitamin A on Lipid Peroxidation and Antioxidation System on chickens artificially induced by Mycoplasma－gallisepticum(MG)，explore the possible mechanism pharmacodynamic action of Vitamin A and decide the rational therapeutical dose.Methods On the base of using the tylosin for conventional therepy，the chickens which had been infected by MG type strains were treated with different dose of Vitamin A for adjunctive therapy，The efficacy of Vitamin A was evaluated through the changes in trachea and lung and serum SOD，MDA in order to explore the possible mechanism pharmacodynamic action of Vitamin A.Results While after treatment with tylosin and Vitamin A，The lung tissue injury was relieved in different degree，Especially in the Vitamin A middle dose group and high dose group;SOD and MDA were recovered in different degree，Especially in the Vitamin A middle dose group，got close to the health group showly(P ＞0.05).Conclusions Vitamin A as a potent antioxldant by means of the inhibition of the lipid peroxidation and increasing organism’s ability to remove free radial could repair the peroxide damage of respiratory system and accelerate lung tissue repair，the rational therapeutical dose was 1 200 IU/kg.

Vitamin A;Chronic Respiratory Disease;Lipid Peroxidation;Antioxidation System

S858.31

A

1007－1474(2016)01－0023－06

2015－10－22