贵州关岭黄牛POMC基因多态性分析

张纯新，徐龙鑫，刘 镜*，何光中

(1.贵州省金沙县农牧局，贵州 金沙 551800;2.贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

贵州关岭黄牛POMC基因多态性分析

张纯新1，徐龙鑫2，刘 镜2*，何光中2

(1.贵州省金沙县农牧局，贵州 金沙 551800;2.贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

为研究阿片黑皮质素前体(POMC)在动物采食和能量平衡中的作用，本研究采用DNA测序技术，对关岭黄牛92头个体的POMC基因的多态性进行研究。结果表明，在扩增片段为870 bp的产物中，发现138C＞T，430C＞T，644C＞T，668C＞T，693A＞G 5个突变位点。多态性结果显示，除430C＞T突变位点处于哈代－温伯格不平衡状态(HWE)(P＜0.05)，其余突变位点均处于HWE平衡状态(P＞0.05)，5个突变位点的多肽信息含量(PIC)均为中度多态。

贵州关岭黄牛;POMC基因;多态性

阿片黑皮质素前体(pro－opiomelanocortin，POMC)是一种蛋白质前体，于1979年通过克隆牛的cDNA而被确认，它可以加工成多种不同功能的肽类激素，包括黑皮质素、促脂解素和β－内啡肽，它们主要参与采食和能量平衡调控［1］。POMC基因和其他几个食欲控制关键基因如Leptin［2］和Leptin受体［3］，多用于人的一些肥胖症的检测。而牛POMC基因位于1个与平均日增重和屠宰重相关的QTL［4］。Buchanan 等［5］利用连锁作图的方法将该基因定位于牛11号染色体上，并且还发现1个距离转录起始位点288 bp的C＞T同义突变，该突变引入了1个BtsⅠ酶切位点，该位点与牛的屠体重、平均日增重、眼肌面积相关。张春雷等［6］研究发现，在牛POMC基因的3’侧翼区存在3个连锁的SNPs且与6月龄体重和0～6月龄平均日增重显著相关。因此POMC基因可能与牛的生长和体重相关。本研究检测了贵州关岭黄牛POMC基因的多态性，以期为提高贵州关岭黄牛生长性能的育种工作提供分子学依据，为全面开发利用贵州关岭黄牛的优良遗传资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 92头贵州关岭黄牛全血样采自贵州省关岭县种群核心保种区。采取的黄牛全血样肝素抗凝，放入冰盒中带回实验室－80℃保存备用。

1.2 基因组DNA的提取 采用蛋白酶K和TaKa-Ra Blood Genome DNA Ex－traction Kit(购于北京天根生物公司)提取基因组DNA。

1.3 引物设计和PCR扩增 根据在Genbank中登录的牛POMC基因序列(Genbank登录号:NC－928357)，使用引物设计软件 Primer Premier 5.0设计1对引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列信息如表1所示。

表1 POMC基因引物序列信息

PCR反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix(购于北京天根生物公司)10 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存备用。

1.4 PCR产物的测序 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收扩增片段，送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.5 数据统计与分析 测序所得的序列用DNAstart软件包中的SeqMan对序列进行校对，用Clustalx程序进行同源性比对。基因型频率、等位基因频率、杂合度等群体遗传参数采用POPGENE生物技术软件处理。

2 结果与分析

2.1 POMC基因SNP检测 贵州关岭黄牛POMC基因PCR扩增片段长度为870 bp，经测序检测，发现138C＞T，430C＞T，644C＞T，668C＞T，693A ＞G 5个突变位点，均存在3种基因型。结果如图1所示。

图1 贵州关岭黄牛POMC基因的测序结果截图

2.2 贵州关岭黄牛POMC基因多态性分析 由表2可见，5个变异位点均是杂合子基因型为优势基因型。138C＞T，430C＞T，644C＞T变异位点C等位基因频率大于T等位基因，668C＞T变异位点T等位基因频率大于C等位基因，693A＞G变异位点A等位基因频率大于G等位基因。X2检测结果表明，除430C＞T变异位点处于HWE不平衡外(P＜0.05)，其他4个变异位点均处于HWE平衡状态(P＞0.05)。5个变异位点的杂合度(He)介于0.419 1和0.499 8之间，有效等位基因(Ne)介于1.721 5和1.999 1之间，多态信息含量(PIC)均呈现中度多肽。

表2 贵州关岭黄牛POMC基因的多态性分析

3 讨论与结论

3.1 候选基因法是一种寻找畜禽重要经济性状遗传标记的常用方法，它可以直接地研究该基因多态性与个体经济性状的关系。本研究通过测序方法对贵州关岭黄牛的POMC基因进行了多态性分析。结果发现5处变异位点，均具有3种基因型。从进化角度看，群体中的遗传多样性是历史的产物［7］，多态性信息含量和杂合度都是群体内遗传变异的重要度量指标，杂合度值越大，群体内的遗传变异就越大。多态信息含量值衡量基因变异程度高低，Botstein等［8］提出衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC＞0.5时，该变异位点为高度多肽，0.25＜PIC＞0.5时为中度多肽基因座，PIC＜0.25时为低度多肽。本研究中5个变异位点的杂合度(He)介于0.419 1和0.499 8之间，多态信息含量(PIC)介于0.331 3和0.374 9之间，均属于中度多肽，研究结果与张春雷等［6］研究结果相类似。根据HWE平衡定律，如果没有选择、突变和迁移等发生，在一个大的随机交配群体内，等位基因频率和基因型频率随世代的增加而保持不变，本研究中，5个变异位点中除430C＞T变异位点外其他变异位点均处于HWE平衡状态。以上结果表明关岭黄牛POMC基因的遗传多样性比较丰富，选择潜力较大。

3.2 POMC基因的突变会导致很多疾病的发生，例如肥胖症、肾上腺功能障碍以及毛色改变等，这都是由POMC基因不同功能肽的突变或者表达水平差异所致［9］。张春雷等［6］研究结果表明，南阳牛的POMC基因变异位点与体重具有关联性，因此POMC基因完全可以作为牛生长性状的潜在遗传标记。

［1］Nakanishi S，Inoue A，Kita T et al.Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotrophin－beta－lipotropin precursor［J］.Nature，1979，278(5 703):423～427.

［2］Montangue CT，Farooqi IS，Whitehead JP et al.Congenital leptin deficiency is associated with severe early－onset obesity in humans［J］.Nature，1997，387(6 636):903～908.

［3］Clement K，Vaisse C，Lahlou N et al.A mutation in the human leptin receptor gene cause obesity and pituitary dysfunction［J］.Nature，1998，392(6 674):398～401.

［4］Thue TD，Buchanan FC.Linkage mapping of POMC to bovine chromosome 11［J］.Anim Genet，2003，24(2):146～160.

［5］Buchanan FC，Thue TD，Yu P et al.Single nucleotide polymorphisms in the corticotrophin－releasing hormone and pro－opiomelancortin genes are association with growth and carcass yield in beef cattle［J］.Anim Genet，2005，36(2):127～131.

［6］张春雷，王艳红，陈宏，等.牛POMC基因多态性及与南阳牛生长性状的相关分析［J］.遗传，2009，31(12):1 221～1 225.

［7］Nei M，Jajima F，Tateno Y.Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular date［J］.Journal of Molecular Evolution，1983，19(3):153～170.

［8］Valizadeh M，Kang K，Kanno A et al.Analysis of genetic distance among nine Medicago species by using DNA polymorphisms［J］.Breeding Science，1996，(46):7～10.

［9］马淑慧，李亚楠，郝晓燕，等.POMC在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位［J］.中国农业科学，2015，48(9):1 818～1 824.

The Polymorphism of POMC Gene in Guanling Cattle

Zhang Chunxin1，Xu Longxin2，Liu Jing2*，He Guangzhong2
(1.Bureau of Animal Husbandry of Jinsha，Jinsha Guizhou 551800，China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinarina of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550005，China)

Pro－opiomelanocortin(POMC)plays an important role on animal ingestive behavior and energy homeostasis.Genetic variation of POMC was detected by DNA sequencing techniques in 92 individuals from Guanling cattle.The results showed that，5 mutation sites(138C ＞ T，430C ＞ T，644C ＞T，668C ＞T，693A＞G)were found in 870 bp amplified fragments.X2test showed that 5 mutation sites were all in HWE(P ＞0.05)but 430C ＞T，Analysis of genetic diversity indicated 5 mutation sites were at intermediate polymorphic status.

Guizhou Guangling Cattle;POMC Gene;Polymorphism

S821.2:Q7

A

1007－1474(2016)01－0001－03

2015－10－19

贵州省科学技术基金［黔科合J字LNK(2013)06号］;贵州省科技厅农业攻关项目，合同编号:黔科合NY字［2011］3068;贵州省现代肉牛产业技术体系建设项目［GZCYTX－03］

张纯新(1968—)，男，高级兽医师，主要从事畜牧生产技术推广工作。

*通讯作者:刘镜(1980—)，男，副研究员，主要从事畜牧生产技术的研究及推广工作。