猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒继发细菌感染病例的实验室诊断

曾秀玲，田海蓉，王 慧，李 涛，刘祥友

(1.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008;2.贵州省乡镇企业环境保护劳动卫生管理站，贵州 贵阳 550001)

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒继发细菌感染病例的实验室诊断

曾秀玲1，田海蓉1，王 慧1，李 涛1，刘祥友2

(1.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008;2.贵州省乡镇企业环境保护劳动卫生管理站，贵州 贵阳 550001)

猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一。实验采集临床疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征病死猪的脏器组织，应用分子生物学和细菌学方法进行实验室确诊。经荧光RT－PCR检测，该病例确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染所致;经细菌分离鉴定和耐药性分析，该病例继发革兰氏阳性球菌感染，头孢氨噻肟对该致病菌抑制效果较好。

猪繁殖与呼吸障碍综合征;细菌;继发感染;诊断

猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种急性接触性传染病，以母猪妊娠后期流产、死胎、产木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪严重呼吸道症状为特征［1～4］。1987年该病首发于美国，随后 2～3年内迅速在北美和欧洲广泛流行，以后蔓延至全世界范围的大流行［5，6］。我国于 1995 年首次从疑似PRRS病例中分离到PRRSV，证实了本病在国内的存在［7］，目前该病在我国感染情况较为严重。

2015年4月，贵州省某养猪场所饲猪出现厌食、消瘦、生长发育迟缓、呼吸困难、母猪流产等类似PRRS症状的疾病。为确诊病因，对1头临床病死母猪内脏组织进行了分子生物学和细菌学检测，确诊为PRRS继发革兰氏阳性球菌感染，现将病例诊断情况介绍如下，为预控疫病流行暴发提供技术支持和诊断参考。

1 材料与方法

1.1 材料 病料采自贵州省某养猪场1头疑似PRRS症状的病死母猪病变内脏组织;PRRSV和猪瘟病毒(CSFV)RNA提取试剂盒及荧光RT－PCR扩增试剂盒购自北京世纪元亨有限公司;细菌分离培养基及药敏纸片为贵州省动物疫病预防控制中心实验室制备保存。

1.2 PRRSV、CSFV核酸检测 取病死母猪的脾脏、肾脏、肺脏及淋巴结无菌研磨成组织匀浆液，以13 000 r/min离心3 min，取上清液使用RNA提取试剂盒提取病料总RNA;以针对PRRSV的荧光RTPCR扩增试剂盒进行实时定量扩增。

1.3 细菌检测

1.3.1 细菌分离培养:无菌采取病死猪肝脏、脾脏、心脏进行涂片，染色，镜检。同时无菌操作划线接种血清琼脂平板培养基，37℃恒温培养箱培养24 h后观察其特征。

1.3.2 药敏试验:挑取培养基上单个菌落划线接种到血清琼脂平板，选择头孢氨噻肟、青霉素、多西环素等10种常用的抗菌素药敏片放于培养基中进行药物敏感试验。

2 结果

2.1 PRRS病原核酸检测结果 以PRRS通用荧光RT－PCR核酸检测试剂盒对从病死猪组织所提基因组RNA进行实时扩增，结果见图1。

由图1可知，从病死猪组织所提基因组RNA中出现特异性扩增曲线，CT值为14.588 9。根据说明书结果判定CT值＜30且出现特异性扩增曲线，为PRRS阳性，初步判定该病死猪为PRRSV感染所致。

图1 PRRS实时荧光RT－PCR扩增结果

2.2 CSF病原核酸检测结果 以CSF通用荧光RT－PCR核酸检测试剂盒对从病死猪组织所提基因组RNA进行实时扩增，结果见图2。

图2 CSF实时荧光RT－PCR扩增结果

由图2可知，从病死猪组织所提基因组RNA中未出现特异性扩增曲线，CT值＜40。根据说明书结果判定CT值＜40且未出现特异性扩增曲线，为CSF阴性，表明病死猪未感染CSFV。

2.3 细菌分离培养结果 无菌采取病死猪肝脏、脾脏、心脏接种于血清琼脂培养基，置37℃培养箱中培养12～24 h，可见血清琼脂培养基上长出乳白色、圆形、边缘整齐、凸起、半透明的菌落。细菌经染色镜检结果为革兰氏阳性球菌，表明病死猪同时继发有革兰氏阳性球菌感染。见图3。

图3 细菌革兰氏染色镜检结果

2.4 药敏试验结果 取上述血清琼脂培养基上生长的细菌纯培养物，选择常用的抗菌素进行药物敏感试验，结果见表1。

表1 细菌药敏试验

由表1可知，头孢氨噻肟对该致病菌抑制效果较好，多西环素、青霉素药敏效果次之。

3 讨论

3.1 本试验采用分子生物学和细菌学方法对临床表现消瘦、呼吸困难、流产等症状病死猪进行了病因确定性诊断。结果，从病死猪病变组织中检测到PRRSV核酸，并从肝脏、脾脏、心脏中分离到革兰氏阳性球菌，表明病死猪感染PRRSV，并继发感染革兰氏阳性球菌。对分离得到的细菌进行药敏试验，结果细菌对10种常用抗生素表现不同的耐药性，以对头孢噻呋钠最为敏感。

3.2 能引起母猪出现繁殖障碍的原因很多，包括环境应激性因素、饲料营养性因素和病原传染性因素等，而能引起猪呼吸系统症状的病原性因素也很多;同时PRRS剖检病变与CSF等疾病极其相似，这给PRRS的临床诊断造成了较大困难［8］。因此，若需确诊PRRS，必须通过实验室诊断。本次诊断依照农业部有关规定，对临床疑似PRRS病例进行荧光RT－PCR检测，确诊该病例为PRRSV感染所致。

3.3 自PRRS在我国出现，尤其是2006年高致病性毒株出现以来，我国的养猪业经济损失巨大。PRRSV是引起免疫抑制的主要病毒之一，感染后猪的免疫功能下降，能继发感染病毒性和细菌性疾病，同时免疫抑制病毒会影响疫苗的免疫效果，促进其他病毒的感染，导致严重发病和死亡［9，11］。此次疫情发生的原因可能为猪群感染PRRSV后继发感染革兰氏阳性球菌。

3.4 针对PRRS常用的措施包括生物安全、疫苗免疫、生产管理(特别是后备母猪)、同群感染、清群、重新引入、封群等，使用疫苗免疫是目前大部分猪场防控PRRS的主要选择［12］。对于PRRS伴发猪链球菌、副猪嗜血杆菌及大肠杆菌等细菌性疾病混合感染时，在感染的高峰期添加抗生素进行药物预防具有重要意义。此外，体内外试验表明替米考星等药物可间接抑制PRRSV的复制，从而降低PRRS所造成的影响［13，14］。

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Laboratory Diagnosis of Secondary Bacterial Infection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Zeng Xiuling1，Tian Hairong1，Wang Hui1，Li Tao1，Liu Xiangyou2
(1.Guizhou Province Animal Disease Control Center，Guiyang Guizhou 550008，China;2.Guizhou Province Township Enterprise Environmental Protection Labor Health Management Station，Guiyang Guizhou 550001，China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)is one of an important the viral infectious diseases in swine industry worldwide.This experiment collected clinical suspected porcine reproductive and respiratory syndrome tissues of pig mortality，application of molecular biological and bacteriological methods of laboratory diagnosis.By fluorescence RT－PCR detection，the case was confirmed to be infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus;bacterial isolation and drug resistance analysis，the case of gram positive bacteria infection，and the inhibition effect of the bacteria on the pathogenic bacteria.

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome;Bacteria;Secondary Infection;Diagnosis

S858.28

A

1007－1474(2016)01－0020－03

2015－10－27

曾秀玲(1972—)，女，主要从事动物疫病病原学研究。E －mail:250433375@qq.com