膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表达水平及临床意义

王友宝　张梁　韩韬　徐向前　祝昌明　王磊　夏青建　郭小刚



·实验研究·

膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表达水平及临床意义

王友宝张梁韩韬徐向前祝昌明王磊夏青建郭小刚

266000 青岛市海慈医疗集团泌尿外科

【摘要】目的研究miR-126与miR-152在膀胱癌患者尿液中的表达，评估二者作为膀胱癌早期诊断标志物的价值。方法采用RT-PCR技术检测52例膀胱癌患者和40例健康对照者尿液中miR-126、miR-152的表达，并通过受试者工作曲线(ROC)分析其诊断效能。结果miR-126在早期膀胱癌患者尿液中表达显著升高(t=6.350，P<0.01)，且与膀胱癌的恶性程度有关；膀胱癌患者尿液中miR-152表达降低(t=3.996，P<0.05)，但与膀胱癌的临床病理特征均无关(P>0.05)；miR-126联合miR-152能够很好地鉴别膀胱癌，敏感性和特异性分别为76.5%、83.6%。结论尿液中的miR-126能够反映膀胱癌的恶性程度，miR-126联合miR-152对膀胱癌的早期诊断具有潜在的价值。

【关键词】膀胱肿瘤；尿液；MicroRNAs；肿瘤标志物

膀胱癌是我国最常见的泌尿系恶性肿瘤，发病率和死亡率较高，早期诊断对膀胱癌的筛查、治疗至关重要[1]。膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查是目前最常用的检查手段，前者为有创检测，患者不易接受[2]。后者虽为一种无创伤性手段，但是敏感性仅有35%[3]。 MicroRNAs(miRNAs)是一种包含19～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA[4]，近年研究发现，部分miRNAs能在膀胱癌患者尿液中稳定表达，对尿液中某些差异表达的miRNAs加以研究或为临床提供一种新型的无创诊断标志物[5]。本研究通过RT-PCR技术检测膀胱癌患者尿液中 miR-126、miR-152的表达变化，并通过受试者工作曲线(ROC)分析二者诊断的敏感性和特异性，探讨二者作为一种新型肿瘤标志物的诊断价值。

材料与方法

一、实验对象

2013年11月至2015年8月在我院泌尿外科收治入院的52例初发膀胱肿瘤患者，其中男36例，女16例，年龄37～84岁，平均64岁。参照WHO 1973病理分级系统和UICC临床分期系统，其中高级别20例，低级别32例；非肌层浸润性38例，肌层浸润性14例。纳入标准：①尿液收集前2周无泌尿系侵入性检查史；②既往无手术、放疗或化疗史；③未合并泌尿系感染、结石及其他部位肿瘤；④患者或家属签署知情同意书，并遵照医嘱正确留取尿液。所入选疑似膀胱肿瘤患者均经病理证实为膀胱尿路上皮癌。同期体检的40例健康志愿者作为对照组，其中男26例，女14例，年龄35～75岁，平均62岁。对照组各项检查结果正常，组间性别、年龄均无统计学差异。

二、主要试剂和仪器

Trizol试剂购于Invitrogen公司，Real-Time PCR Kit(LK-0101A)、总RNA提取试剂盒均购自上海Novland公司。所用仪器主要包括Stratagene公司生产的MX3000P型实时荧光定量PCR仪、日立产U2000紫外可见分光光度计、 Eppendorf 公司生产的EP5417R型台式低温高速离心机。

三、方法

1.尿液的收集及总RNA的提取：收集受检者中后段晨尿100 ml，并在2 h内于4 ℃下、3 000 g离心15 min去除尿液沉渣，然后将上清再次以12 000 g 离心10 min，用去RNA酶处理过的 EP管收集上清1.5 ml，做好标记立即放在液氮中速冻并置于-80 ℃冰箱中保存备用。严格参照Invitrogen公司Trizol说明书提取冻存尿液上清中的总RNA，并使用紫外线分光光度计测定230、260和280 nm的吸收值，计算RNA的纯度和浓度，以筛选达标样本做后续实验。

2.引物的设计与合成：引物采用Primer Premier 5.0软件设计，由Novland公司合成，具体序列参照表1。

表1　用于实时定量PCR的引物

3.RT-PCR：以2 μl的总RNA为模板逆转录合成cDNA，使用miR-126、miR-152的特异性引物进行逆转录反应，于PCR扩增仪26 ℃孵育30 min、42 ℃ 孵育30 min、85 ℃孵育10 min，结束后立即将cDNA产物置于冰块上防止降解。实时荧光定量PCR的反应过程如下：变性95 ℃，3 min；退火95 ℃，12 s; 延伸60 ℃，40 s，扩增40个循环后对结果进行分析，以U6RNA作为内参基因，测定循环阈值(CT)，采用2-△△CT的方法计算miR-126、miR-152的相对表达强度(RQ)，其中 ΔΔCT=膀胱癌组(CT目的miRNA-CTU6) -健康对照组(CT目的miRNA-CTU6)。每个样本每个基因3个重复，精密度满足进一步分析要求。

四、统计学方法

结果

一、尿液中miR-126、miR-152的表达水平

健康对照组中miR-126、miR-152的表达水平分别为2-△△CT=2.16±1.33、2-△△CT=1.03±0.22。与健康对照组相比，膀胱癌患者尿液中的miR-126表达显著升高(2-△△CT=9.49±5.51，t=6.350，P<0.01)，且尿液中miR-126的表达与膀胱癌的恶性程度有关(P<0.05)，恶性程度越低miR-126的表达升高越显著；而尿液中miR-152表达相对降低(2-△△CT=0.89±1.29，t=3.996，P<0.05)，但与膀胱癌的临床病理特征均无关(P>0.05)，详见表2。本实验中膀胱癌患者尿液中miR-126/miR-152比值远高于正常对照组(t=7.602，P<0.01)，但其比值在不同肿瘤分期、分级间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2　膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表达水平与临床病理特征的相关性±s)

二、尿液中miR-126、miR-152的临床诊断价值及效能

鉴于miR-152普遍低表达，所以结合高表达的miR-126应该有更好的诊断价值，图1为ROC分析miR-126及其与miR-152比值对膀胱肿瘤的诊断价值曲线，当最佳切点定在15.11时，miR-126/miR-152比值诊断膀胱癌的特异性和敏感性分别为83.6%、76.5%，诊断效能均比单独采用miR-126要好，详细数据见表3。

表3　尿液中miR-126、miR-152对膀胱肿瘤诊断价值的ROC曲线分析

图1　尿液中两种miRNA对膀胱肿瘤诊断的ROC曲线

讨论

膀胱癌作为一种高度异质性的疾病，一旦发生侵袭或转移预后极差[6]，因此亟需一种新型的肿瘤标志物提高早期诊断率。膀胱镜检查是目前术前诊断和术后随访的“金标准”，虽然在检查过程中能够很好的直观病灶以及取样活检，但是患者往往很抵触这种昂贵且痛苦的侵入性检查，另外一些平坦型病变或原位癌也是膀胱镜检查的盲区[2]；尿脱落细胞学检查是一种无创伤性手段，但敏感性太低，且泌尿系的结石、感染、取尿和检测技术差异也常会影响尿细胞学检查结果[3]。近年来膀胱癌患者尿液肿瘤标志物的研究受到很大的关注， FDP、BTAstat、 ImmunoCyt、BTAtrak、NMP22和尿荧光原位杂交技术(FISH)已经被美国FDA批准并用于膀胱癌的检测，另外一些潜在的标志物如存活素、端粒酶、CYFRA21-1等也在膀胱癌的临床研究中显示出了较高的特异性和敏感性，但由于炎症、结石、放疗史等干扰因素使得这些肿瘤标志物的特异性仍然普遍低于尿细胞学检查[7-9]。因此，至今仍然没有一种理想的非侵入性检查手段应用于膀胱癌的术前诊断与术后随访。

理想的生物学标志物应该具有高灵敏度和特异性、取材与检查方便快捷、成本低廉，miRNAs在多种泌尿系肿瘤中的表达改变和生物学功能受到极大关注。一些miRNAs的表达水平确实在肿瘤组织和正常组织中存在差异[10]，而尿液中存在的miRNAs和尿路上皮肿瘤也有着千丝万缕的联系，由于尿液与肿瘤组织的直接接触，肿瘤细胞及其释放的相关miRNAs会在尿液中有着不同程度的表达[11]，因此选取尿液中某些异常表达的miRNA加以研究有可能成为早期诊断和治疗膀胱肿瘤的突破点[12]。

尿液是泌尿系疾病诊断中最理想的检测载体，取样无创性，患者容易接受。尿液中的miRNAs能够很好的耐受pH值和高活性的RNase，在室温下放置24 h内不易降解，这使得尿液中稳定存在的miRNAs更利于临床检测[13]。由于尿液中的miRNAs主要来自脱落的上皮细胞以及由尿路上皮细胞主动释放的以微囊泡、外泌体等形式包裹的miRNAs，使得尿液中miRNAs具有极高的特异性[14]。 miR-126和miR-152 是肿瘤研究的热点因子，有学者发现miR-152 在膀胱肿瘤组织中的表达水平相比健康组织明显下调[15]，同样膀胱癌患者尿液中的miR-152 水平也要普遍低于健康对照组[16]；此外， miR-126在膀胱癌患者尿液中的表达水平也明显高于健康对照组[17]，本实验我们也证实了miR-126在膀胱癌患者尿液中高表达，并发现miR-126与肿瘤的临床分期和病理级别密切相关，能很好的评估膀胱癌的恶性程度。经ROC曲线分析发现miR-126/miR-152的比值诊断膀胱癌的特异性和敏感性分别为83.6%、76.5%，这种诊断效能也已经相当高，提示二者结合具有很好的诊断潜力，对患者治疗方案的选择和预后评估都会有一定的意义。

然而本实验仍然存在一些不足之处，本次纳入样本量偏少，目前内参基因的选择也存在争议，另外市场上也缺乏专门针对尿液中miRNAs的检测试剂等。尽管这些研究数据需要经受长期的临床试验，但不失为当今临床诊断开辟一条新的思路，随着新技术的出现，一种精确可行的非侵入型肿瘤标志物会有更好的应用前景。

参考文献

[1]Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Tschirdewahn S, Vom Dorp F. Diagnostics of nonmuscle-invasive urothelial cell carcinoma of the bladder[J]. Urologe A,2015,54(4):480-483.

[3]Van Rhijn BW, van der Poel HG, van der Kwast TH. Urine markers for bladder cancer surveillance: a systematic review[J]. Eur Urol,2005,47(6):736-748.

[4]Rico-Rosillo MG, Vega-Robledo GB, Oliva-Rico D. The role and importance of the microRNAs in the diagnosis and development of diseases[J]. Rev Med Inst Mex Seguro Soc,2014,52(3):302-307.

[5]Schwarzenbach H, Nishida N, Calin GA, et al. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer[J]. Nat Rev Clin Oncol,2014,11(3):145-156.

[6]那彦群,叶章群,孙颖浩. 中国泌尿外科疾病诊断治疗指南[M]. 北京:人民卫生出版社,2013：21-28.

[7]Lokeshwar VB, Habuchi T,Grossman HB, et al. Bladder tumor markers beyond cytology: International Consensus Panel on bladder tumor markers[J]. Urology,2005,66(6 Suppl 1):35-63.

[8]Hosseini J, Golshan AR, Mazloomfard MM, et al. Detection of recurrent bladder cancer: NMP22 test or urine cytology[J]. Urol J,2012,9(1):367-372.

[9]Casadio V, Bravaccini S, Gunelli R, et al. Accuracy of urine telomerase activity to detect bladder cancer in symptomatic patients[J]. Int J Biol Markers,2009,24(4):253-257.

[10]刘国元,陈凌武,徐庆春,等. 膀胱癌组织中miRNA-720、miRNA-191差异表达的意义[J]. 现代泌尿生殖肿瘤杂志,2014,6(3):164-167.

[11]Miah S, Dudziec E, Drayton RM, et al. An evaluation of urinary microRNA reveals a high sensitivity for bladder cancer[J]. Br J Cancer,2012,107(1):123-128.

[12]Snowdon J, Boag S, Feilotter H, et al. A pilot study of urinary microRNA as a biomarker for urothelial cancer[J]. Can Urol Assoc,2013,7(1-2):28-32.

[13]Mall C, Rocke DM, Durbin-Johnson B, et al. Stability of miRNA in human urine supports its biomarker potential[J]. Biomark Med,2013,7(4):623-631.

[14]Nazimek K, Filipczak-Bryniarska I, Bryniarski K. The role of medicaments, exosomes and miRNA molecules in modulation of macrophage immune activity[J]. Postepy Hig Med Dosw(Online),2015,69:1114-1129.

[15]Köhler CU, Bryk O, Meier S, et al. Analyses in human urothelial cells identify methylation of miR-152, miR-200b and miR-10a genes as candidate bladder cancer biomarkers[J]. Biochem Biophys Res Commun,2013,438(1):48-53.

[16]Jiang X, Du L,Wang Li, et al. Serum microRNA expression signatures identified from genome-wide microRNA profiling serve as novel noninvasive biomarkers for diagnosis and recurrence of bladder cancer[J]. Int J Cancer,2015,136(4):854-862.

[17]Hanke M, Hoefig K, Merz H, et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer[J]. Urol Oncol,2010,28(6):655-661.

(本文编辑：熊钰芬)

基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0226)

通信作者：王友宝，E-mail:734182987@qq.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.02.010

Corresponding author:WANG You-bao,E-mail:734182987@qq.com

(收稿日期：2016-01-04)

The expression of urine miR-126, miR-152 in bladder cancer and its clinical value

WANGYou-bao,ZHANGLiang,HANTao,XUXiang-Qian,ZHUChang-ming,WANGLei,XIAQing-jian,GUOXiao-gang.

DepartmentofUrology,QingdaoHiserHospital,Qingdao266000,China

【Abstract】ObjectiveTo explore urine miR-126, miR-152 expression in bladder cancer and evaluate its clinical value as early diagnosis markers.MethodsUrine miR-126, miR-152 of 40 cases of healthy controls and 52 patients with bladder cancer were assayed by RT-PCR, and its diagnostic value was evaluated by the ROC curve.ResultsThe expression of urine miR-126 in bladder cancer patients was significantly raised (t=6.350, P<0.01), it significantly correlated with malignant degree. But the expression of urine miR-152 was downregulated (t=3.996, P<0.05), while not related to clinicopathological features (P>0.05), miR-126 combine with miR-152 identifying bladder cancer was commendable, the sensitivity and specificity was 76.5%, 83.6% respectively.ConclusionsUrine miR-126 can response to the malignant degree of bladder cancer, miR-126 combined with miR-152 has potential value to the early diagnosis of bladder cancer.

【Key words】Urinary bladder neoplasms;Urine;MicroRNAs;Tumor markers