miR-195-3p在肾癌中的表达及其临床意义研究

潘翔　全晶　金露　桂耀庭　杨尚琪　毛向明　来永庆



·实验研究·

miR-195-3p在肾癌中的表达及其临床意义研究

潘翔全晶金露桂耀庭杨尚琪毛向明来永庆

230032 合肥，安徽医科大学(潘翔、全晶、金露)；北京大学深圳医院男性生殖实验室(桂耀庭)；北京大学深圳医院泌尿外科(杨尚琪、毛向明、来永庆)

【摘要】目的研究miR-195-3p在肾癌与癌旁组织及肾癌细胞与正常细胞系中的表达差异，分析差异表达与患者临床病理特征间的关系，探究其临床意义。 方法提取27例配对标本(组织及细胞系)的总RNA，经过逆转录、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测标本中miR-195-3p标本中的表达量，统计分析miR-195-3p在不同组织、细胞系间的表达差异及其与临床病理特征间的相关性。通过转染上调和下调miR-195-3p，并进行细胞增殖实验(MTT)，评估miR-195-3p对肾癌细胞增殖的影响。结果miR-195-3p在肾癌组织(18例，66.67%)及肾癌细胞系中的表达较癌旁组织及正常细胞系明显上调(P<0.05)，miR-195-3p在肾癌中的表达量与患者的年龄、性别、癌组织类型、TNM分期、AJCC分期无明显相关性(P>0.05)。miR-195-3p在肾癌细胞系(ACHN、786-O)表达上调后促进肾癌细胞增殖，表达下调后抑制肾癌细胞增殖。结论miR-195-3p在肾癌组织中明显升高，并且促进肾癌细胞增殖，提示其可能与肾癌的发生发展有一定关系。

【关键词】肾癌；miR-195-3p

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是肾脏恶性肿瘤中最为常见的一种，世界范围内，RCC是排名第14位的常见恶性肿瘤，其在北美和欧洲的发病率和死亡率远高于发展中国家，且发展中国家的发病率仍在不断上升[1-2]。研究发现早期RCC的5年存活率显著高于晚期，因此早期发现、早期治疗对肾癌的治疗有着至关重要的作用[3]。但是，目前肾癌的发生、发展机制尚不明确，临床也未曾应用一些生物标志物对肾癌进行诊断、治疗或评估其预后，肾癌的早期发现十分困难。因此，以肾癌的发生机制为基础去寻找可用于肾癌早期诊断或者靶向治疗或判断其预后的生物标志物是有必要的[4]。

miRNA是一种短链非编码RNA，只有大约22个核苷酸。miRNA能够非特异性地结合mRNA上的靶基因, 通过降解或抑制其转录来调控基因的表达[5]。miRNA在多种生物进程的转录后调控中起着至关重要的作用[6]。它不但在肿瘤的发生发展和转移中发挥作用，而且在肿瘤的治疗上也起着十分重要的作用，miRNA或将成为一种治疗肿瘤的潜在的药物[7]。研究表明，miR-195在某些类型的肿瘤中起抑制作用，在癌细胞过度表达之后，miR-195 能够抑制细胞周期进程和肿瘤细胞的入侵[8-9]。miR-195有两个成熟序列，分别是miR-195-5p和miR-195-3p。miR-195-3p位于17号染色体p13.1，且与其他miRNA(如miR-497)形成集群组成miR-15家族[10]。在前期测序的基础上，本研究对肾癌及其癌旁组织中有表达差异的miR-195-3p进行了qRT-PCR验证比较，分析miR-195-3p的表达量与患者临床病理特征间的关系，以期为miR-195-3p在肾癌发生发展中的作用机制以及对肾癌的诊断价值等后续临床研究奠定良好的基础。

材料与方法

一、组织标本

采集27例RCC和配对癌旁正常组织(取自可见RCC 病灶外约2.0 cm 处)标本，RCC组织均由北京大学深圳医院病理科确诊，癌旁正常组织均由该病理科经显微镜确认不含肾癌组织。本研究经北京大学深圳医院伦理委员会审查并批准，参与研究的患者均已签署知情同意书。临床分期采用2009年国际抗癌组织(UICC)/美国癌症联合会(AJCC)临床分期标准，组织学分类采用WHO 2004年RCC病理分类标准。研究中所有标本供者均具有完整的临床病理资料。见表1。

表1　miR-195-3p表达水平与临床病理特征间的关系

二、细胞培养

人胚肾细胞系：HEK-293T。人肾癌组织细胞系：ACHN、786-O、769P。细胞于含有DMEM(含10%胎牛血清、1%抗生素、1%谷氨酰胺)的培养液中，37 ℃、5% CO2恒温箱中培养。

三、总RNA 的提取

Trizol试剂提取液氮下碾磨后标本中的总RNA，测定总RNA 浓度(使用NanoDrop2000c紫外分光光度计，Thermo Scientific，USA)。

四、总RNA 反转录为cDNA

在反应体系中加入1 μg 总RNA，在普通PCR 仪(BIO-RAD，USA)上进行逆转录。使用microRNA专用反转录试剂盒miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen，Germany)，反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。

五、qRT-PCR 检测miR-195-3p的表达量

miR-195-3p上游引物为：5’-CCAATATTGGCTGTGCTGCTCC-3’，下游引物为Qiagen 公司提供的通用引物。内参基因采用U6 snRNA，其上游引物为:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系:模板cDNA l μl，miR-195上游引物1 μl, 10*miScript通用引物2 μl, 2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加无酶水至总反应体积20 μl。使用仪器：LC480 荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems，USA)。反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共计40个循环。

六、细胞转染

使用lip2000对miR-195-3p的mimic，inhibitor进行转染，对照为mimic NC(negative control)和inhibitor NC。miR-195-3p mimic正义链：5’-CCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCC-3’，反义链：5’-AGCAGCACAGCCAAUAUUGGUU-3’。Mimic NC 正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。miR-195-3p inhibitor 序列：5’-GGAGCAGCACAGCCAAUAUUGG-3’。Inhibitor NC序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

七、细胞增殖实验(MTT)

使用MTT检测细胞增殖水平，铺96孔板中，使每孔细胞大约为3 000个，约24 h后进行转染，在0、24、48、72 h加入20 μl MTT在37 ℃温箱孵育4 h 后，换成150 μl DMSO, 在酶标仪(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上检测OD值。

八、统计学方法

肾癌及其癌旁组织中miR-195-3p表达水平采用配对t检验进行比较，miR-195-3p表达水平与患者临床病理特征的关系采用χ2检验或Fisher确切概率分析，取P<0.05为具有统计学意义。统计软件为SPSS 23.0。标准化处理将U6作为内参，在qRT-PCR中所得数据使用ΔΔCT 法进行分析：ΔCT= CT正常/癌组织-CTU6，ΔΔCT=ΔCT癌组织-ΔCT正常。通过计算2-ΔΔCT得到癌组织中miR-195-3p相对于其配对的癌旁组织中表达量的倍数。计算OD值，分析经过转染后肾癌细胞增殖水平变化。

结果

一、miR-195-3p在肾癌及其癌旁组织的表达量

通过2-ΔΔCT计算miR-195-3p在肾癌组织中相对癌旁组织的表达倍数并作图，发现 miR-195-3p在肾癌组织中的表达量明显高于其癌旁组织(P<0.05)。见图1。计算2-ΔΔCT可得到miR-195-3p在肾癌组织中相对其癌旁组织中表达量的倍数的平均值±标准误，其大小为4.344±0.482，最小值为0.002 5，最大值为556.4。miR-195-3p在肾癌及其相应的癌旁组织中的相对表达量比值经过对数转换后，表达上调的例数为18例(66.67%)，表达下调的为9例(33.33%)。见图2。

二、miR-195-3p表达水平与临床病理特征的相关性

以肾癌组织中miR-195-3p的相对表达量的平均值4.344为界，经四格表χ2检验分析，将所研究的病例分为高表达组、低表达组，其中低表达15例，高表达12例。结果发现肾癌组织中miR-195-3p表达水平与患者年龄、肾癌组织类型、性别、AJCC 临床分期、TNM 分期无明显相关性(P>0.05)。见表1。

三、miR-195-3p在不同肾癌细胞系与正常细胞系中的表达水平

miR-195-3p在肾癌细胞系相对于正常细胞系的表达量为：ACHN 3.24±0.94；786-O 32.33±10.71；769P 3.88±0.57；293T 1.00±0.13。miR-195-3p在肾癌细胞系中的表达明显高于正常细胞系，以786-O细胞系最为显著。见图3。

四、转染效率验证

经qRT-PCR验证，转染miR-195-3p mimic后 miR-195-3p的表达水平在ACHN细胞系中提高328.37倍，在786-O细胞系中提高424.58倍。转染miR-195-3p inhibitor后miR-195-3p的表达水平在ACHN细胞系与786-O细胞系中分别被敲低了71.79%和74.59%。见图4。

五、miR-195-3p提高肾癌细胞增殖水平

在786-O细胞系中，与转染mimic NC相比，转染miR-195-3p mimic于24、48、72 h的增殖水平提高了3.65%(P<0.05)、10.37%(P<0.05)、25.34%(P<0.01)；与转染inhibitor NC相比，转染miR-195-3p inhibitor于24、48、72 h的增殖水平下降了4.38%(P<0.01)、 9.83%(P<0.01)、8.29%(P<0.01)。见图5。

在ACHN细胞系中，与转染mimic NC相比，转染miR-195-3p mimic于24、48、72 h的增殖水平提高了5.42%(P<0.01)、10.88%(P<0.01) 和17.78%(P<0.01)，与转染 inhibitor NC相比，转染miR-195-3p inhibitor于24、48、72 h的增殖水平下降了5.69%(P<0.05)、9.21%(P<0.01) 和 6.41%(P<0.01)。见图6。可见，miR-195-3p可以提高肾癌细胞的增殖水平，故miR-195-3p可促进肾癌细胞生长。

图1　miR-195-3p在肾癌及相应的癌旁组织中的相对表达倍数分析(X轴Normal代表正常组织，Cancer代表肾癌组织，Y轴代表肾癌组织相对癌旁组织的表达倍数)图2　miR-195-3p在肾癌和相应的癌旁组织中的相对表达量比值经对数转换后结果(X轴代表组织例数，Y轴代表肾癌与相应的癌旁组织中的相对表达量比值经对数转换后结果)图3　miR-195-3p在ACHN、786-O、769P、293T中的相对表达量(X轴为4种细胞系，Y轴是miR-195-3p在ACHN、786-O、769P、293T相对于293T的表达量)图4　转染后miR-195-3p在ACHN与786-O细胞系表达水平图5　786-O细胞系中转染后细胞增殖水平的OD值变化(X轴表示时间，Y轴表示OD值大小)图6　ACHN细胞系中转染后细胞增殖水平的OD值变化(X轴表示时间，Y轴表示OD值大小)

讨论

RCC是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，约占成人恶性肿瘤的2%[11]。基于RCC的临床结果和生物特性，RCC主要分为透明细胞癌、乳头状癌、嫌色细胞癌等几种病理类型[12]。而透明细胞癌是最常见的RCC病理类型，约占RCC的80%[4]。与大多数肿瘤相同，肾癌发生发展的具体机制暂不明确，手术切除依然是RCC唯一确定的治疗措施，但是仍然有20%～40%的患者在行肾切除术后面临着复发的可能[13]。故而寻找可用于肾癌早期诊断或治疗的药物显得更为重要。

据近期文献报道，miR-195在许多类型的癌症中发挥着十分重要的作用，包括神经胶质瘤、结直肠癌、乳腺癌等[14-16]。推测，miR-195可能是癌症发展的关键。实验研究证实miR-195通过直接针对细胞周期蛋白D1和E1的3’UTRs来抑制人类神经胶质瘤细胞增殖[14]。miR-195通过bcl-2(23) 促进细胞凋亡和抑制结肠、直肠的致瘤性[15]。在乳腺癌组织中miR-195表达下调，诱导miR-195的表达能促进细胞凋亡并能抑制乳腺癌的生存细胞，数据显示miR-195能够结合Raf-1 mRNA 的3’UTR从而抑制Raf-1的表达[16]。Subramanian等[17]的研究表明miR-195是Raf-1表达的直接负调节物并且同时抑制Raf-1和MEK激酶使结肠癌细胞凋亡增加。在肝细胞癌和胰腺癌中miR-195的表达也是下调的[18-19]。

有关miR-195作为结肠癌生物标志物的研究表明[17]， miR-195表达下调与结肠癌预后差、淋巴结转移相关联。miR-195在子宫颈癌、骨肉瘤、肾上腺皮质癌和乳腺癌中也被描述为生物标志物[20-24]。有研究发现miR-195对乳腺癌检测具有更高的灵敏度[25]。低表达水平的miR-195可以显著预测HER2阳性乳腺癌患者的生存率[23]。也有文献报道血清中miRNA(miR-16-2*，miR-195，miR-2861，miR-497)可用于高精度辨别宫颈上皮内瘤变[23]。而下调的miR-195可以预测预后不良的骨肉瘤或肾上腺皮质癌[20-21]。由上可见，miR-195可作为诊断、靶向治疗或预后多种癌症的潜在的生物标志物。

本研究发现miR-195-3p在肾癌中表达上调，提示其在肾癌中的作用机制与其他肿瘤有所不同。qRT-PCR实验结果显示miR-195-3p在肾癌中明显高表达，其表达水平为癌旁正常组织的(4.344±0.482)倍，提示其可能在肾癌发生发展中发挥着促癌基因的作用。统计学分析未发现miR-195-3p的表达水平与患者年龄、性别、临床病理特征、TNM分期、AJCC临床分期之间的联系，但这不能排除其与临床病例数偏少所造成的偏倚误差有关，需要更大的样本量才能进一步对实验进行验证。细胞增殖实验中，在786-O及ACHN细胞系中miR-195-3p可提高肾癌细胞增殖水平。

现通过实验已明确miR-195-3p在肾癌及其癌旁组织中的表达存在差异，下一步将收集更多的实验标本，以验证miR-195-3p的表达水平与患者年龄、性别、临床病理特征、TNM分期、AJCC临床分期之间是否存在一定的联系。并用体外转染的实验方法对miR-195进行其他的功能方面的研究，主要包括肾癌细胞的转染后侵袭、凋亡等。这些研究将有助于阐明肾癌发生发展的分子机制，并对肾癌的早期诊断及其治疗与判断预后起到至关重要的作用。

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(本文编辑：徐汉玲)

基金项目：国家自然科学基金(81101922)；深圳市科技研发资金知识创新计划基础研究项目(JCYJ20130402114702124、JCYJ20150403091443329)；广东省重点医学专科经费

通信作者：来永庆，E-mail:yqlord@163.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.02.009

Corresponding author:LAI Yong-qing,E-mail:yqlord@163.com

(收稿日期：2016-01-08)

The expression and clinical significance of miR-195-3p in renal cell carcinoma

PANXiang*,QUANJing,JINLu,GUIYao-ting,YANGShang-qi,MAOXiang-ming,LAIYong-qing.

*AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression level of miR-195-3p in the renal cell carcinoma(RCC)， paired normal tissues, RCC cell lines and normal kidney cell line, and analyze the relationships between the expression level of miR-195-3p and clinicopathologic of patients and explore its clinical significance.MethodsTotal RNA was isolated from 27 RCC tissues and paired adjacent normal tissues. Reverse transcription and real time quantitative PCR (qRT-PCR) were used to detect the expression of miR-195-3p. The relationships between the expression of miR-195-3p in tissues and cell lines with clinicopathologic characteristics was analyzed. To assess the function of miR-195-3p in RCC cell lines, cell proliferation assay (MTT) were performed on cells after up-regulating or down-regulating miR-195-3p.ResultsThe expressionof miR-195 in RCC tissues and cells was significantly higher than paired adjacent normal tissues and cells (P<0.05), and 18 (66.67%) RCC tissues showed up-regulation in all tissues which had detected miR-195-3P. The results showed that there were no relationships between the expression of miR-195-3P with patients’gender, age, histology, TNM stage and AJCC stage (P>0.05).Over-expression of miR-195-3p could promote RCC cell (786-O and ACHN) proliferation, while down-regulation of miR-195-3p could suppress cell proliferation. ConclusionsmiR-195-3P is up-regulated in RCC tissue, and promotes the proliferation of RCC cells. It is indicated that miR-195-3P might be involved in the tumorigenesis and development of RCC.

【Key words】Kidney neoplasms;miR-195-3p