不同针灸方法对膝骨关节炎模型细胞因子及基质金属蛋白酶影响的比较研究

陈益丹，邱华平，金肖青，彭　芳

(1.浙江中医药大学第三临床医学院，杭州　310053；2.浙江医院，杭州　310013；3.杭州市上城区紫阳街道社区卫生服务中心，杭州　310002)



不同针灸方法对膝骨关节炎模型细胞因子及基质金属蛋白酶影响的比较研究

陈益丹1,2，邱华平3，金肖青2，彭芳2

(1.浙江中医药大学第三临床医学院，杭州310053；2.浙江医院，杭州310013；3.杭州市上城区紫阳街道社区卫生服务中心，杭州310002)

【摘要】目的比较针刺、温针灸、电针三种不同针灸方法对膝骨关节炎模型白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的影响，探讨不同针灸方法治疗膝骨关节炎在关节软骨基质代谢方面的差异。方法选用新西兰兔30只，随机分为正常组、模型组、针刺组、温针灸组及电针组，每组6只。通过切断前交叉韧带建立实验性膝骨关节炎模型，各治疗组选取“后三里”、“犊鼻”穴，分别施以单纯针刺、温针灸及电针治疗，共治疗20次。治疗结束后采用ELISA法检测各组血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3及TIMP-1水平，并比较组间各指标的差异。结果与模型组比较，各治疗组血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平均明显下降(P < 0.05或P < 0.01)，温针灸组MMP-3水平明显升高(P < 0.05)；各治疗组间比较，电针组MMP-3水平低于针刺组、温针灸组(P < 0.01)，IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平各治疗组间比较差异无统计学意义(P >0.05)。结论针刺、温针灸、电针均能调节膝骨关节炎模型血清中异常的IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平，使软骨退行性变的部分因素得到控制，从而起到延缓软骨退变的作用，其中温针灸的调节作用较为显著。

【关键词】骨性关节炎；针刺；温针灸；电针；细胞因子；基质金属蛋白酶

关节软骨的退变是骨关节炎的特征性病理学改变，正常状态下，关节软骨基质的分解和合成维持着动态的平衡，这一过程受多种细胞内外的蛋白分子及关节软骨酶的调控。研究表明细胞因子(cytokine) 和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)及其特异性组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)与关节软骨的降解、骨关节炎的发病密切相关[1-3]。针灸治疗膝骨关节炎是被临床广泛使用的非手术方法，多采用单纯针刺、电针或温针灸等方法，不同的针灸方法在临床均被证实有效[4-6]。近年来针灸治疗膝骨关节炎的实验研究表明，各种针灸方法治疗膝骨关节炎具有延缓软骨退变的作用[7-9]，但目前不同针灸方法在延缓软骨退变作用的异同尚不清楚。因此本研究拟通过建立兔膝骨关节炎模型，观察并比较单纯针刺、温针灸、电针治疗在膝骨关节炎软骨代谢相关指标的变化与异同，为临床针灸方法的选择提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验动物及分组

清洁级新西兰兔30只，雌雄各半，体重2～2.2 kg，由浙江中医药大学动物实验中心提供【SCXK(浙)2010-0042】，生产单位：新昌县大市聚镇欣健兔场。动物实验环境设施为浙江中医药大学动物实验研究中心【SYXK(浙)2013-0184】。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。动物在实验环境中适应性饲养1周，一般情况良好开始进行实验。随机选取6只作为正常组，其余24只建立膝骨关节炎模型。将建模后的24只新西兰兔根据随机数字表随机分为模型组、针刺组、温针灸组及电针组，每组各6只。

1.2主要试剂及仪器

兔IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测试剂盒(美国Rapibio Lab公司)；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司)；Sunrise吸光酶标仪(瑞士TECAN公司)；Baso 2002-2离心机(台湾贝索公司)；MDF-5410医用低温保存箱(日本SANYO公司)；DK-600型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3动物模型的建立

模型组和治疗组均采用右侧膝关节切断前交叉韧带(Anterior Cruciate Ligament Transection,ACLT)制备膝骨关节炎模型。3%戊巴比妥钠1 mL/kg 耳缘静脉注射麻醉，麻醉后即予首次肌注青霉素钠每只40 万U预防感染，术野皮肤常规无菌操作，从右侧膝关节内侧髌骨旁切口进入，切断内侧副韧带及前交叉韧带，确认抽屉试验阳性，术中注意止血，用青霉素钠生理盐水清理伤口，逐层缝合后放入笼中单独饲养，自由饮食。术后5 d每只新西兰兔每天肌注40 万U青霉素钠以预防手术创口感染。

1.4干预方法

穴位定位根据新世纪全国高等中医药院校创新教材《实验针灸学》中“常用实验动物针灸穴位”的规定，穴取右侧“犊鼻”、“后三里”穴，犊鼻位于髌韧带外侧凹陷处；后(足)三里位于小腿背外侧上1/5折点处，约当腓骨头下1.2 cm，胫骨嵴后1 cm。造模完成一周后开始对各治疗组患侧膝关节进行针灸治疗，穴取“犊鼻”、 “后三里”，隔日治疗一次，十次为一个疗程，连续治疗二个疗程，疗程间隔5 d。针刺组单纯针刺20 min；电针组采用2/100 Hz疏密波，强度1～2 mA，以新西兰兔下肢微微抖动为度，每次电针20 min；温针灸组针刺后将1 cm长度艾段置于针柄上点燃，为避免皮肤局部烫伤可垫纸片，待艾柱燃尽后起针。模型组造模完成后不作针刺处理，同步饲养。正常组不造模、不针刺，同步饲养。模型组、正常组与治疗组进行相同的抓取与固定。

1.5血清指标测定

治疗结束后第2天进行血清取材。将动物固定于兔架上耳缘静脉采血10 mL，静置后3000 r/min离心10 min，分离血清后分装于Eppendorf管，-70 ℃低温冰箱中保存，以备统一检测。采用ELISA法测定血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的水平，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.6统计学方法

2结果

2.1各组血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1浓度比较

与正常组比较，模型组IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1浓度显著升高(P<0.01)，MMP-3水平明显降低(P<0.01)，TIMP-1变化无统计学差异(P>0.05)；针刺组与电针组MMP-3水平明显降低(P<0.05或P<0.01)；电针组TIMP-1水平较正常组低(P<0.05)。与模型组比较，各治疗组血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平均降低(P<0.05或P<0.01)，温针灸组MMP-3水平明显升高(P<0.05)。各治疗组间比较：电针组MMP-3水平低于针刺组及温针灸组(P<0.05或P<0.01)，TIMP-1低于针刺组(P<0.05)，IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平各治疗组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(见表1)。

组别groupsIL-1βTNF-αTGF-β1MMP-1MMP-3TIMP-1空白组Control104.42±26.9921.90±5.872.40±0.890.94±0.2564.84±7.601.93±0.26模型组Model406.28±34.52★★76.40±5.93★★20.31±12.13★★1.45±0.32★★32.02±5.78★★1.89±0.26针刺组Acupuncturegroup74.13±5.71△△14.15±1.19△△2.87±0.55△△0.64±0.18△△39.66±6.56★1.88±0.08温针灸组Warm-needleacupuncturegroup120.44±29.74△△25,21±6.40△△4.40±2.55△△0.99±0.31△53.57±10.61△1.80±0.26电针组Electro-acupuncturegroup110.05±13.39△△21.24±2.42△△3.59±0.99△△0.80±0.12△△22.23±4.33★★■■※※1.59±0.08★△■

注：与空白组比较，★P< 0.05，★★P< 0.01；与模型组比较，△P< 0.05，△△P< 0.01；与针刺组比较，■P< 0.05，■■P< 0.01；与温针灸组比较，※※P< 0.01。

Note：★P< 0.05，★★P< 0.01 vs. control group;△P< 0.05，△△P< 0.01 vs. model group;■P< 0.05，■■P< 0.01 vs. acupuncture group;※※P< 0.01 vs. warm-needle acupuncture group.

3讨论

膝骨关节炎是一种以软骨进行性破坏，伴随骨质增生反应的退行性疾病，这种软骨的破坏源自软骨内细胞外基质合成与降解稳态的失衡[10]。软骨基质的正常结构和功能有赖各种细胞因子的调控，其中白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)可以引起基质降解过程中多种酶的产生，包括基质金属蛋白酶家族，抑制Ⅱ型胶原的合成，引起软骨基质的破坏，抑制软骨基质的修复，最终导致关节软骨的破坏，是KOA病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的最重要的细胞因子[11-12]。转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)对软骨细胞的分化和基质合成起刺激作用[13]，TGF-β1在正常表达情况下对软骨是一种保护性因子，但在病理条件下TGF-β1表达的异常升高也会对软骨造成损坏，并诱发骨赘形成[14]。TGF-β1对软骨组织的作用有剂量-效应关系，当其分泌增多时，可与其他分解性细胞因子协同作用，抑制细胞增殖，促进软骨基质降解，进一步加重软骨损伤[15]，因此早期抑制TGF-β1可以影响骨关节炎过程中骨赘形成的速度[16]，是治疗OA的一种潜在治疗方法[17]。基质金属蛋白酶被认为是软骨退变的有关媒介，研究表明MMP-1、MMP-3的异常表达在骨关节炎关节软骨退变的病理过程中发挥关键作用[18-19]，膝骨关节炎MMP-1、MMP-3水平明显升高[20-23]。

本研究结果显示模型组具有软骨破坏作用的IL-1β、TNF-α、MMP-1与具有一定软骨修复作用的TGF-β1水平均明显升高，取得了与既往研究一致的结果[15,23-24]，而模型组MMP-3水平较空白组降低，与既往研究结果不一致[20-22]，Poleni[25]曾报道TGF-β1可降低MMP-3的表达，本研究中MMP-3的降低是否与TGF-β1水平的升高有关需进一步研究证实。本研究观察时间点为造模后8周，为骨关节炎的早中期病变阶段[26]，本研究结果提示早中期膝骨关节炎模型处于软骨破坏与修复共存的状态，而经过针刺、温针灸、电针早期干预治疗后可明显抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1的表达，使保护性和降解性因子之间的失调趋于平衡。由此可见不同的针灸方法在治疗膝关节骨性关节炎的作用机制是相似的，均可通过调节细胞因子IL-1β、TNF-α、基质金属蛋白酶MMP-1及TGF-β1而发挥其延缓软骨退变的作用。

单纯针刺、温针灸、电针三种不同针灸方法治疗模型膝骨关节炎比较发现，在调节TGF-β1及MMP-1方面是一致的，均能显著降低TGF-β1及MMP-1水平。本研究结果显示温针灸在改善MMP-3的表达优于针刺组及电针组，且对IL-1β、TNF-α、TGF-β1及MMP-1均能调节至正常水平，表明温针灸通过抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1及MMP-1水平，升高MMP-3水平实现修复关节软骨的作用，从而延缓软骨退变，治疗膝骨关节炎。临床也证实治疗膝骨关节炎温针灸总体疗效优于单纯针刺[27]，缓解关节僵硬症状优于电针[28-29]。膝骨关节炎中医属于“痹症”范畴，寒湿在骨关节炎的发病中至关重要，因此温针灸在针刺基础之上结合艾灸的温热效应，起到改善局部循环，温经通络的作用，能明显改善疼痛、关节活动等症状[5]。本研究结果提示临床治疗膝骨关节炎，采用针刺、温针灸、电针进行早期干预均具有延缓软骨退变的作用，其中温针灸疗法在调节失衡的炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3及TGF-β1优势明显。

由此我们得出结论：膝骨关节炎的早期针灸干预治疗，单纯针刺、温针灸、电针均有较明显的调节软骨代谢相关因子的作用，但效应仍有一定的差异性，其中温针灸作用最为明显，其具体作用机制需进一步深入研究。

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〔修回日期〕2016-12-25

[基金项目]浙江省自然基金项目(LQ13H270001)；浙江省中医药管理局项目(2012ZQ003)；浙江省中西医结合老年医学重点学科项目(2012-XK-A04)。

[作者简介]陈益丹(1978-)，女，博士生，研究方向：针灸治疗骨性关节炎的临床和基础研究。E-mail: chenyidan0908@126.com。

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2016) 01-0042-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.008

A comparative study on influence of cartilagemetabolism factors onknee osteoarthritis experimental model with acupuncture, warm needle acupuncture and electro-acupuncture

CHEN Yi-dan1,2，QIU Hua-ping3，JIN Xiao-qing2，PENG Fang2

(1. Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2. Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China； 3. Ziyang Community Health Service Center of Shangcheng District， Hangzhou 310002,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of acupuncture,warm-needle acupuncture, electro-acupuncture on cartilage metabolism-related factors of the experimental knee osteoarthritis model, and explore the similarities and differences of mechanism in different kinds of acupuncture treatment. MethodsNew Zealand rabbits were equally randomized into control, model,acupuncture, warm-needle acupuncture and electro-acupuncture groups. KOA model was duplicated by anterior cruciate ligament transaction (ACLT). After KOA model was established one week, acupointsof“Dubi”(ST35),“Zusanli”(ST36) were used for treatment with different acupuncture treatmentstwenty times totally. The concentration of IL-1β, TNF-α, TGF-β1,MMP-1,MMP-3 and TIMP-1 in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). ResultsIn comparison with control group, the concentration of IL-1β, TNF-α, TGF-β1,MMP-1 increased significantly in model group(P < 0.05),while MMP-3 reduced significantly(P < 0.05); compared with model group, IL-1β,TNF-α, TGF-β1,MMP-1 reduced significantly in each treatmentgroup(P < 0.05 or P < 0.01),MMP-3 increased significantlyin warm-needle acupuncture group(P < 0.05); comparison of IL-1β,TNF-α, TGF-β1,MMP-1in serum was not statistically significant (P >0.05) between treatment groups; MMP-3, TIMP-1 were significantly lower in electro-acupuncture group compared with acupuncture and warm-needle acupuncture group (P < 0.05 or P < 0.01).ConclusionsAcupuncture,warm-needle acupuncture and electro-acupuncture all can regulate cartilage metabolism-related factors and effectively delay cartilage degeneration,especially warm-needle acupuncture.

【Key words】Osteoarthritis; Acupuncture; WarmNeedleAcupuncture; Electro-acupuncture; Cytokine; Matrix metalloproteinase