分散固相萃取-HPLC-MS/MS法测定椰汁中Y-壬内酯

王玉健，庞道标，梁振纲，黄惠玲，庄鹏，董存柱（.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口5703；2.海南大学环境与植物保护学院，海南海口570228）



分散固相萃取-HPLC-MS/MS法测定椰汁中Y-壬内酯

王玉健1，庞道标1，梁振纲1，黄惠玲1，庄鹏1，董存柱2，*
（1.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口570311；2.海南大学环境与植物保护学院，海南海口570228）

摘要：建立了分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定椰汁中γ-壬内酯含量的方法，对提取条件、流动相、质谱条件进行了研究，并对γ-壬内酯可能的断裂机理进行了推测。待测样品直接用乙腈提取，PSA分散固相萃取，采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测正离子模式扫描，选择m/z 157.1/139.1、m/z 157.1/121.1作为γ-壬内酯的定性、定量离子对，外标法定量。γ-壬内酯在0.025μg/mL～0.50μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，仪器检出限为0.025 μg/mL，方法的检测限为0.10mg/kg，定量限为0.40 mg/kg，添加水平为0.10、0.20、0.40 mg/kg时γ-壬内酯的平均回收率范围分别为92.4%～98.4%，相对标准偏差为6.8%～7.6%（n=10）。

关键词：γ-壬内酯；椰汁；分散固相萃取；高效液相色谱-串联质谱

饱和内酯类化合物是一类非常重要的食用香料，天然存在于各种水果中，现已广泛用于各种饮料焙烤食品等食用香精的配方中［1］。γ-内酯是γ-羟基羧酸分子内酯化得到的一类内酯类化合物，它们富含奶香、果香，具有留香时间长、香气圆润等特点［2］。γ-壬内酯是γ-内酯中的典型代表化合物［3］，具有椰子香气，有油脂气息［4］，可用于需有油脂气息的香精及调味香精（例如椰子及杏仁香精）之中。虽然GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中γ-壬内酯被认为是一种“自我限量”的添加物，它的添加量往往受到消费者的接受程度的控制［5-6］，一般情况下不会出现超量使用的问题，但是随着食品工业的日益发展，香精香料使用的逐渐普遍，消费者的味蕾对于香味的识别阈值也在逐年提高，可能造成食用香精香料在使用过程中逐渐增量［7-8］，从而带来健康隐患。因此，建立椰汁中γ-壬内酯含量的检测方法是很有必要的。

目前鲜见关于食品中γ-壬内酯检测方法的文献报道。本文采用超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了同时定性、定量测定椰汁中γ-壬内酯含量的方法，方法前处理简单、快速，适用性强。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 1200超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；API 4000Q四极杆质谱仪（配有电喷雾离子源）：美国ABI公司；Harvard II针泵：美国Varian公司；MS3 Basic旋涡混匀器：广州IKA公司；Centrifuge 5810R离心机：Eppendorf公司；G-285电子天平：Mettler公司；氮吹仪：美国Caliper公司。

乙腈、甲酸为色谱纯试剂：美国TEDIA公司；γ-壬内酯（纯度95%）：美国ChromaDex公司；其余试剂均为分析纯。标准溶液：用乙腈配制成100 mg/L标准储备液，0℃～4℃避光保存。

1.2样品处理

称取待测样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，加入10mL乙腈，涡旋振荡2min，加入4g无水硫酸镁和10g氯化钠，涡旋混合1min，以4000r/min离心5 min，取上清液0.5 mL于玻璃离心管中，加入50 mg PSA吸附剂，混合30 s后离心5 min，取上清液，加入0.5 mL水，涡旋混匀后过0.2 μm有机滤膜，待测。

1.3色谱条件

色谱柱为Accucore Phenyl-Hexyl（100 mm×3 mm i.d.，2.6μm）；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液。梯度洗脱程序：0～3.0 min，10%A～90%A；3.0 min～4.0 min，保持90%A；4.0 min～4.1 min，90%A～10%A；4.1 min～7.0 min，保持10%A。流速：0.60 mL/min，进样量：10 μL。

1.4质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；多反应监测（MRM）；离子源温度：500℃；离子源电压：5 000 V；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气。MRM监测离子对、去簇电压及碰撞电压见表1。

表1　γ-壬内酯的质谱优化条件Table 1　The opimized MS/MS conditions of imazalil and pyrimethanil

2　结果与讨论

2.1提取条件的选择

乙腈作为一种通用的提取溶剂在残留检测方面得到广泛的应用，由于其对糖、蛋白质类化合物较难提取［9-10］，对γ-壬内酯有较高的回收率，因此本文采用乙腈作为提取试剂，以最大限度地提取椰汁中的γ-壬内酯，并使提取液中的干扰物较少。

2.2仪器分析条件的选择

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液等流动相对γ-壬内酯的峰形和分离效果。结果表明，以甲醇-水为流动相时，目标化合物色谱峰略有拖尾。而加入0.1%甲酸有利于γ-壬内酯的离子化，可提高灵敏度，峰形也较好。因此本文选择以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相。

2.3质谱条件的选择

将γ-壬内酯标准品溶液采用流动注射直接进样，通过全扫描确定化合物母离子，再对母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子，通过优化条件，得到二级质谱图。通过多反应离子监测（MRM）选择相对丰度较高的离子对，确定为定性定量离子对，并优化去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）等参数，优化后的质谱条件见表1。

2.4断裂机理推测

γ-壬内酯分子式为C9H16O2，相对分子质量为156.2。γ-壬内酯可能的断裂方式如图1所示。

图1　γ-壬内酯可能的断裂方式Fig.1　Possible fragmentation mechanism of γ-nonanolactone

即分子离子峰m/z 157重排开环，然后脱去一个水分子，得到m/z 139的碎片离子峰；而m/z 139的碎片离子峰重排后形成六元环，再通过氢迁移重排丢失一个水分子，正电荷转移至碳上，形成较稳定的共轭体系，得到m/z 121的碎片峰。

图2为γ-壬内酯子离子全扫描质谱图。

图2　γ-壬内酯子离子全扫描质谱图Fig.2　Product ions full scan mass spectra of γ-nonanolactone

γ-壬内酯母离子157.1产生的子离子分别为m/z 139.1、69.1、121.1、97.1，由于试剂空白在69.1有干扰，因此根据子离子的丰度，本文选择m/z 139.1、121.1作为γ-壬内酯的定量离子。

2.5线性关系及检出限

以空白样品基质配制一系列不同浓度的混合标准工作溶液（0.025、0.050、0.075、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.0 μg/mL），并依次进样，分别以γ-壬内酯的峰面积Y为纵坐标，以相应的浓度值X为横坐标，作标准曲线，结果表明，γ-壬内酯在0.025 μg/mL～0.50 μg/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程Y=937X（r=0.999 1）。

为检验方法的稳定性和重复性，对相同浓度的标准溶液进行同日内不同时间段10次重复进样，γ-壬内酯峰面积的变异系数为1.59%，表明本方法的重复性和稳定性良好。

以实际检测时的信噪比（RSN）为3作为检出限，仪器的检出限为0.025 μg/mL，方法的检测限为0.10 mg/kg，定量限为0.40 mg/kg。γ-壬内酯及阳性椰汁样品MRM色谱图见图3、图4。

图3　γ-壬内酯标样的MRM色谱图Fig.3　MRM chromatogram of γ-nonanolactone standards

图4　阳性椰汁样品MRM色谱图Fig.4　MRM chromatogram of incurred positive sample

2.6回收率与精密度试验

采用标准添加法，在5 g（精确至0.01 g）阴性椰汁样品中进行3个水平（0.10、0.20、0.40 mg/kg）、10平行的添加回收试验，测定后得到γ-壬内酯的回收率和相对标准偏差。在试验条件下，3个添加水平下γ-壬内酯的平均回收率范围为92.4%～98.4%，相对标准偏差为6.8%～7.6%（见表2）。

表2　3个添加水平下γ-壬内酯的平均回收率和相对标准偏差（n=10）Table 2　Spiked recoveries and RSDs of γ-nonanolactone（n=10）

椰汁阴性样品和标准添加样品的MRM色谱图见图5。

图5　椰汁样品中γ-壬内酯残留的MRM色谱图Fig.5　MRM chromatogram of γ-nonanolactone in coconut milk

2.7实际样品的检测

使用本方法对10个市售椰浆和果肉椰汁样品进行了检测，结果在其中4个样品中检出了γ-壬内酯，含量分别为46.4、3.97、0.319、43.6 mg/kg。

3　结论

本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了椰汁中γ-壬内酯含量的测定方法，方法前处理简单、快速，操作简便易行，且准确、灵敏度高，重现性好，检出限低，具有较强的实用性。

参考文献：

［1］孙宝国，何坚.香料化学与工艺学［M］.2版.北京：化学工业出版社，2004：373-391

［2］孙宝国.食用调香术［M］.北京：化学工业出版社，2003：296-300

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［4］邵军强，戴怡凤，刘永国，等.α，β-不饱和γ-内酯的合成及香气特征研究［J］.日用化学工业，2013，43（4）：294-297，302

［5］TIMOTHY B A，ROBERT L S.Issues and challenges in the safety evaluation of food flavors［J］.Toxicology Letters，2004，149（1/3）：209-213

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［8］汤晨，张蕾，仇智宁.试论食用香精香料安全性［J］.粮食与油脂，2012（7）：50-51

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［10］GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ R M，RIAL-OTERO R，CANCHOGRANDE B，et al.Determination of 23 pesticide residues in leafy vegetables using gas chromatography-ion trap mass spectrometry and analyte protecants［J］.Journal of Chromatography A，2008，1196/ 1197：100-109

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.026

基金项目：国家质检总局科技计划项目（2013IK153）；海南省重点科技计划项目（ZDXM2014083）；国家自然科学基金项目（31360447）；海南省自然科学基金项目（212018；313105）

作者简介：王玉健（1979—），女（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品中有毒有害物残留检测。

*通信作者

收稿日期：2015-05-23

Determination of γ-Nonanolactone in Coconut Juice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled
with High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yu-jian1，PANG Dao-biao1，LIANG Zhen-gang1，HUANG Hui-ling1，ZHUANG Peng1，DONG Cun-zhu2，*

（1.Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau China，Haikou 570311，Hainan，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：A dispersive solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method with dispersive solid phase extraction was established for the determination of γnonanolactone in coconut juice.The effect of extration condition，flow phase，and tandem mass spectrometry parameters were investigated.And the possible fragmentation mechanisms of γ-nonanolactone were presumed.The sample was extracted with acetonitrile and determined under the multiple reaction monitoring（MRM）mode by employing external method.The precursor-product ion pair m/z 157.1/139.1 was selected as qualitative ions，and m/z 157.1/121.1 was selected as quantitaive ion.The calibration curve was linear in the range of 0.025 μg/mL～0.50 μg/mL.The limits of detection were 0.025 μg/mL for the instrument and 0.10 mg/kg for the method respec tively.The LOQ was 0.40 mg/kg for the method.The average recoveries of γ-nonanolactone were between 92.4%and 98.4%at spiked levels of 0.10，0.20 mg/kg and 0.40 mg/kg with relative standard derivation（RSDs）of 6.8%～7.6%（n=10）.

Key words：γ-nonanolactone；coconut juice；dispersive solid-phase extraction；high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry