茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵物的抗氧化作用

王谦，安雪，刘敏（河北大学生命科学学院，河北保定071002）



茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵物的抗氧化作用

王谦，安雪，刘敏
（河北大学生命科学学院，河北保定071002）

摘要：以香菇柄、山楂叶为主料，按照一定比例制备固态发酵培养基，将茯苓转接到固态发酵基质中培养，将满管8 d后的固态发酵物烘干；通过超声波提取方法对茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵物和原料基质中总黄酮进行提取，经对比可知，固态发酵物中总黄酮含量要高于原料基质中的含量；固态发酵物中含有多糖、总黄酮等功能因子，具有抗氧化、延缓衰老的作用，通过加压提取的方式获得固态发酵提取液和原料基质提取液后，取适量提取液添加到玉米油、卵黄中，发现固态发酵提取液的抗脂质过氧化作用要显著优于原料基质组；因此将固态发酵提取液开发成功能食品，具有很广阔的发展前景。

关键词：茯苓；香菇柄-山楂叶；总黄酮；脂质过氧化

香菇柄和山楂叶均属于农林废弃物，但其含有多种功能物质。香菇柄与菌盖一样富含多糖、蛋白质、嘌呤等成分，具有提高免疫力［1］、抗病毒、抗血脂的作用，目前已有将香菇柄开发成食品［2-3］，如香菇脯、香辣香菇酱［4］；山楂叶具有活血散结、抗氧化、温补开胃等作用［5］。我国广西、江西等地的药材规则中都存在山楂叶药用的记载，并且山楂叶于2005年正式收录于《中国药典》［6］。山楂叶含有多种生物活性物质，如总黄酮类物质［7］可调节血脂、多酚类成分，是抗氧化作用的重要活性物质［8］。将茯苓菌在以香菇柄-山楂叶为主料固态发酵的方式，不仅使固态发酵物中富含多种功能因子，更重要的是符合经济的可持续发展战略。在前面报道的文章中可知，固态发酵物中多糖、氨基酸含量显著高于原料基质组［9］，本研究中将对两种复合物中总黄酮含量进行对比，通过功能学试验对固态发酵提取液和原料基质提取液进行研究，证明通过固态发酵的方式制备的固态发酵物，是否具有优越性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

香菇柄、山楂叶：由河北大学食药用真菌研究生提供；芦丁（纯度UV≥98%）：天津市光复科技发展有限公司；玉米油、鸡蛋：市售。

蛋白/核酸分析仪（CECIL9560）：英国Cecil；超声波细胞粉碎机：宁波海曙科生超声设备有限公司；722型分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1芦丁标准曲线的绘制

将芦丁标品烘干至恒重后，精密称取10 mg芦丁标品于装有25 mL 50%无水乙醇的烧杯中，超声处理45 min使其溶解，将芦丁溶液置于50 mL容量瓶中，加50%无水乙醇至刻度，摇匀备用。通过蛋白/核酸分析仪对芦丁溶液进行全波长扫描，确定芦丁的最大吸收波长。

精密量取芦丁标准品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别装于10 mL容量瓶中，加50%无水乙醇至刻度，震荡摇匀，以50%无水乙醇为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度值，绘制标准曲线［10］。

1.3.2两种培养物中总黄酮含量的测定

（2）乡镇畜牧兽医工作人员的专业性不强。2008年兽医体制改革后，乡镇级兽医站实现人、财、物三权规乡镇。乡镇级兽医站工作人员承担了过多的业务工作以外的工作。另外，乡镇兽医站经费短缺。

将两种培养物烘干后，各称取0.2 g溶于20 mL 50%无水乙醇中，超声处理45 min后，6 000 r/min离心6 min，合并上清液，加50%无水乙醇至20 mL。精密量取1 mL于10 mL容量瓶中，加50%无水乙醇至刻度。以50%无水乙醇为空白对照，在最大吸收波长处测两种培养物的吸光度值，计算总黄酮含量。

1.3.3碘标准曲线的制作

取一系列10 mL比色管，加入40∶60（体积比）异辛烷-冰乙酸［11］5 mL，再分别加入碘标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，摇匀后，各加入1.0 mL的淀粉指示剂，加水至刻度后，摇匀，静置5 min，以蒸馏水为空白对照，于535 nm处测吸光度值。

1.3.4固态发酵提取液和原料基质提取液抗玉米油过氧化作用

精确量取0.5 mL玉米油于干燥的10.0 mL试管中后，加入40∶60（体积比）的异辛烷-冰乙酸5 mL，之后再加入饱和KI溶液0.5 mL，轻轻摇匀后，加入固态发酵提取液和原料基质提取液各1mL，对照组加入1.0 mL蒸馏水，摇匀后反应3 min，取出后加入10 g/L淀粉溶液1.0 mL，之后加水稀释至刻度，摇匀后静置5 min，取分层后的上清液，于535 nm处测吸光度值［12-13］，统称为OD1。由于固态发酵提取液和原料基质提取液有一定的颜色，为了避免颜色的干扰，取两种提取液各1 mL 于10mL比色管中，加蒸馏水至刻度后，摇匀，于535nm处测吸光度值，统称为OD2，则最终OD值为OD1减去OD2。

1.3.5卵黄悬液的制备

将新鲜鸡蛋的蛋壳轻轻敲碎，分离蛋黄，用滤纸轻轻吸取残余蛋清，将卵膜划破收集卵黄，用0.1 mol/L pH 7.4的PBS按1∶1（体积比）配成悬液后并稀释成1∶25（体积比），混匀备用［14］。

1.3.6卵黄固态发酵提取液和原料基质提取液的抗卵黄脂质过氧化作用

向比色管中加入上述卵黄悬液0.3 mL，然后分别加入固态发酵提取液和原料基质提取液1 mL，对照组加入1 mLPBS，再加入25 mmol/L的硫酸亚铁0.2 mL，用0.1 mol/L pH 7.4 PBS补至5 mL，置于37℃水浴震荡50 min，取出后加入20%的三氯醋酸0.5 mL，静置10 min后，4 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.8%硫代巴比妥酸1.0 mL，532 nm［15-16］处测光度值，统称为OD1；重复以上操作，加入硫代巴比妥酸后，拧紧管口，100℃下水浴15 min，对照组以PBS代替上清液，532 nm处测光度值，统称为OD2；最终OD值为OD1减去OD2。

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

芦丁最大吸收波长如图1所示。

图1　芦丁最大吸收波长Fig.1　The maximum absorption wavelength of rutin

根据扫描结果可知，在257 nm和364 nm处有最大吸收峰，选取364 nm为芦丁的最大吸收波长。

以50%无水乙醇为对照，在364 nm处测定不同浓度的芦丁溶液的吸光度值，并绘制芦丁标准曲线，如图2所示。

2.2未经茯苓菌发酵的原料基质和固态发酵物中总黄酮含量比较

未经茯苓菌发酵的原料基质和固态发酵物中总黄酮含量比较如表1所示。

由表1可知，相同质量的两种培养物中，固态发酵物中总黄酮含量明显高于未经茯苓菌发酵的原料基质中总黄酮含量。

图2　 芦丁标准曲线Fig.2　Standard curve of rutin

表1　两种复合物中的总黄酮含量Table 1　Total flavonoids concentration of extract two complex

2.3碘标准曲线的绘制

碘标准曲线如图3所示。

图3　碘标准曲线Fig.3　Standard curve of iodine

2.4添加两种提取液后玉米油过氧化值的测定

通过碘标准曲线，分别计算出加入蒸馏水、原料基质提取液、固态发酵提取液后产生的碘的质量；通过下列公式计算出玉米油的过氧化值。

式中：X1为样品的过氧化值，g/100 g；X2为样品过氧化值，meq/kg；m为样品的吸光度值对应的碘质量，mg；m1为样品质量，g。

玉米油中的过氧化值如表2所示。

表2　玉米油中的过氧化值Table 2　The peroxide value of corn oil

由表2可知，与空白对照组相比，向玉米油中加入固态发酵提取液和原料基质提取液后，对玉米油的过氧化作用均有抑制效果，其中加入固态发酵提取液后，玉米油的过氧化值最低，说明固态发酵提取液的抗油脂过氧化能力高于原料基质提取液的能力。

2.5固态发酵提取液抗卵黄的脂质过氧化研究作用

抑制率/%=（OD对照－OD样品）/OD对照×100，式中：OD对照为对照组的吸光度值；OD样品为样品的吸光度值本试验中，添加固态发酵提取液和未发酵提取液后的抑制情况如表3所示。

表3　固态发酵提取液对卵黄脂质过氧化的抑制作用Table 3　Solid-state fermentation extract of yolk inhibition of lipid peroxidation

由表3可知，在卵黄体系中，加入一定浓度的固态发酵提取液和原料基质提取液后，对卵黄的脂质过氧化均有抑制作用，说明这两种提取液均具有抗氧化的能力；试验结果中固态发酵提取液的抑制率更高，说明通过茯苓菌的固态发酵后，使固态发酵物中合成了新的功能因子或者增多了原有的功能因子，也进一步说明了固态发酵过程是有很大必要的。

3　结论

在玉米油脂质过氧化试验、卵黄脂质过氧化试验中，加入固态发酵提取液和原料基质提取液后，均抑制了玉米油和卵黄的脂质过氧化反应，说明了原料基质具有抗氧化的功能物质，如多糖、总黄酮类等，在前面的试验中也确实证实了这一点；两个功能学试验中，添加固态发酵提取液后，对油脂和卵黄的过氧化的抑制情况均优于添加原料基质提取液组，说明经过茯苓菌固态发酵得到的固态发酵物中确实产生了新的功能因子，或者增多了原来的功能物质，才使得其抗氧化作用增强。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.007

基金项目：河北省现代农业产业技术体系食用菌创新团队（冀农科发［2013］23号）

作者简介：王谦（1962—），男（汉），研究员，本科，从事食药用真菌研究与开发工作。

*通信作者

收稿日期：2015-05-20

Antioxidation of Solid Yeast of Poria Cocos-Roots of Lentinus Edodes-Hawthorn Leaf

WANG Qian，AN Xue，LIU Min

（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

Abstract：According to certain proportion to prepare solid state fermentation medium of root of lentinus edodes and hawthorn leaf as main ingredient，cultivated solid-state fermentation substrates switching tuckahoe，and dryed solid yeast of the full 8 days.By ultrasonic extraction method of poria cocos-roots of lentinus edodeshawthorn leaf solid fermentationcompoungs and medium to extract total flavonoids in raw materials，the total content of flavonoids in the solid state yeast was higner than raw material content of the matrix in contrast.Functional factors such as polysaccharides，flavonoids contained in solid yeast had antioxidant，anti-aging effect. Added adequate amount of solid-state fermentation extract and raw material after matrix obtained by means of pressurized extraction to the corn oil and egg yolk，founded that solid-state fermentation extract of lipid peroxide oxidation resistance was significantly better than the raw material base.So that developed solid-state fermentation to be funtied food will have the very broad development prospects.

Key words：poria cocos；root of lentinus edodes and hawthorn leaf；total flavonoids；lipid peroxidation