湖北钉螺指名亚种与滇川亚种半数冬眠温度差异的实验研究

荣大伟，王　亮，汪　雁，周宪民,3，邹节新,3



湖北钉螺指名亚种与滇川亚种半数冬眠温度差异的实验研究

荣大伟1，王亮1，汪雁2,3，周宪民1,3，邹节新1,3

1.南昌大学医学院寄生虫学教研室,南昌330006;2.南昌大学医学院医学遗传与细胞生物学实验室,南昌330006;3.南昌大学鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室,南昌330047

摘要：目的比较湖北钉螺指名亚种与滇川亚种对低温的适应性差异。方法野外分别采集江西省星子县新池乡的湖北钉螺指名亚种和四川省天全县新华乡的滇川亚种钉螺，选取经逸蚴法检测为阴性且活力好的成体螺为研究对象，在冬季将其置于人工气候箱中饲养，起始饲养温度为13 ℃，按1 ℃/2 d的速率逐渐降低饲养温度，直至0 ℃。饲养温度每降低1 ℃，各取出一组钉螺测定其冬眠率及死亡率；另以湖北钉螺指名亚种为对象，用上述方法，在次年夏季重复实验。采用Probit回归分析方法分别计算两亚种、冬夏两季的半数冬眠温度(ET50)并对其差异性进行比较。结果四川省天全县的湖北钉螺滇川亚种与江西省星子县的湖北钉螺指名亚种的ET50及95%可信区间分别为0.483 ℃(-0.440 ℃～1.332 ℃)和2.435 ℃(1.695 ℃～3.146 ℃)，两亚种ET50的95%的可信区间无重叠，有统计学差异；江西省星子县的湖北钉螺指名亚种在夏季和冬季的ET50及95%可信区间分别为2.046 ℃(1.331 ℃～2.745 ℃)和2.780 ℃(2.094℃～3.532 ℃)，两者ET50的95%可信区间有重叠，无统计学差异。结论湖北钉螺滇川亚种与指名亚种的ET50存在差异，湖北钉螺指名亚种夏季与冬季的ET50无差异。

关键词：湖北钉螺指名亚种；湖北钉螺滇川亚种；冬眠率；半数冬眠温度

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湖北钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主。钉螺的孳生与分布，直接影响着血吸虫病的流行与传播。湖北钉螺可分为多个亚种，对于其分类国内外学者存在一定争议。目前存在以表观遗传性状[1]为特征的“五亚种观点”，以“种群遗传学”[2]为特征的“三亚种观点”及以基于DNA序列的遗传多态性[3]为分类依据的“四亚种观点”。但是，尽管湖北钉螺亚种分类尚存争议，然而分布在四川、云南省境内的滇川亚种以及分布在长江中下游两岸湖沼洲滩的指名亚种为大多数学者所认可。钉螺作为一种水陆两栖动物，具有冬眠习性，在自然条件下每年11月中旬至次年3月为冬眠期。研究表明冬季处于冬眠状态的湖北钉螺体内酚氧化酶低于非冬眠状态[4]。钉螺冬季溶菌酶活性却高于其他季节[5]。钉螺耗氧量随温度降低而减少，二者存在直线回归关系，钉螺耗氧量与冬眠率间也存在明显的直线回归关系[6]。死亡率随冬眠所处温度降低而升高[7]。目前，在实验室环境下，多以测定钉螺的ET50来研究温度对钉螺的影响，但相关研究均是仅对一个亚种开展研究，本研究拟对比湖北钉螺滇川亚种和指名亚种间ET50及冬夏两季湖北钉螺指名亚种内ET50的差异，可进一步了解温度对钉螺的影响，为控制钉螺的孳生与分布提供依据。

1材料和方法

1.1对象湖北钉螺滇川亚种(Oncomelaniahupensisrobertsoni，O.h.robertsoni)天全株与指名亚种(Oncomelaniahupensishupensis，O.h.hupensis)星子株,实验前分别采自四川省天全县新华乡(N 30°06′36″E 102°52′52″)和江西省星子县新池乡江滩(N 29°26′32″E 115°57′40″)，选择经逸蚴法检测结果阴性且活力好的成体螺为研究对象。

1.2 仪器设备 RXZ-380B型人工气候培养箱，亚都(YADU)EB35B 超声波加湿器，FOI-2WW LED光纤冷光源，欧姆龙(OMRON) 体温计MC-342FL，手工粗草纸。

1.3方法

1.3.1冬眠温度测定参考周卫川等[8]方法，钉螺饲养环境采用粗草纸饲养法。在直径为9 cm的培养皿的底部衬湿润草纸，并控制含水量(以草纸面上无积水为宜)，检测时每天加水保持相同湿度。于冬季将从野外采集的两亚种地域株成体螺放入培养皿，每个培养皿放50只钉螺。起始饲养温度为13 ℃，以后按1℃/2 d的速度，逐渐降低饲养温度,降至0 ℃为止。每降低1 ℃分别取出两亚种钉螺各一培养皿，并判定其冬眠和死亡状态，计算其冬眠率和死亡率。另以湖北钉螺指名亚种星子株为实验对象，于次年夏季重复以上实验。

1.3.2钉螺冬眠状态的判断方法观察经过上述方法诱导后闭厣或不爬动的钉螺，计算其闭厣率，另用解剖针刺激其厣部或软体。如钉螺无反应，再将其放置于13℃的温水中复苏，数小时后能恢复正常的钉螺，记为初反应螺，再将未复苏钉螺置于室温下湿润草纸中央，48 h后，观察钉螺爬行状况，离开中央位置钉螺记为次复苏钉螺，仍处于中央未爬行钉螺记为死亡，初复苏螺及次复苏螺总数记为冬眠钉螺数。

1.3.3数据统计分析采用SPSS18.0统计分析软件对实验数据进行统计分析。采用Probit回归分析方法对湖北钉螺指名亚种与滇川亚种种间的ET50、夏季与冬季湖北钉螺指名亚种种内的ET50进行比较。

2结果

2.1经以1 ℃/2 d的降温速率下，来自四川省天全县的湖北钉螺滇川亚种的ET50及95%可信区间为0.483 ℃(-0.440 ℃～1.332 ℃)与江西省星子县的湖北钉螺指名亚种的ET50及95%可信区间为2.435 ℃(1.695 ℃～3.146 ℃)的可信区间无重叠，故二者ET50有统计学差异(图1)。

2.2经以1 ℃/2 d的降温速率下，来自江西省星子县的湖北钉螺指名亚种夏季的ET50及95%可信区间为2.046℃(1.331 ℃～2.745 ℃)与冬季的ET50及95%可信区间为2.780 ℃(2.094 ℃～3.532 ℃)的可信区间有重叠，故二者ET50无统计学差异(图2)。

图1　湖北钉螺指名亚种及滇川亚种冬季冬眠率

图2　湖北钉螺指名亚种夏季、冬季冬眠率

3讨论

本研究在实验室条件下以1 ℃/2 d的降温速率对比湖北钉螺两亚种、冬夏季节冬眠情况，来探讨其对低温的适应性。结果显示来自四川省天全县的湖北钉螺滇川亚种比来自江西省星子县的指名亚种更能适应低温的环境；我们认为导致这一结果可能有多种原因：包括孳生环境(海拔高度、气温、湿度、植被、土壤等)、亚种间固有属性等[14]，洪青标[9]等在实验中证明了钉螺对低温的耐受性在干燥环境中比在潮湿环境中弱；庄建林[10]等研究表明，采用快速降低温度冷驯化钉螺时并不影响其半数致死温度，而采用长时间冷驯化时可提高钉螺的耐寒能力；Ansart A[11]等研究表明光照是影响螺类耐寒能力的主要因素，光照时间越短，冬眠温度越低。

江西省星子县的湖北钉螺指名亚种夏季的ET50与冬季的ET50无统计学差异。该结果说明湖北钉螺的冬眠与季节无必然联系，而仅是耐受低温的一种适应性表现。

本实验结果江西省星子县的湖北钉螺指名亚种的ET50为2.435 ℃，与洪青标等[9]报道的湖北钉螺指名亚种的ET50为5.87 ℃，庄黎等[12]报道的湖北钉螺指名亚种的ET50高于6 ℃，杨鹏[13]报道的湖北钉螺滇川亚种的ET50为5.312 ℃等结果并不一致，产生这种差异的原因可能为：1) 不同研究所用的钉螺采集自不同地点，可能存在ET50的差异。2) 实验中湖北钉螺冬眠状态判定过程中包括由研究者观察针刺钉螺后有无应激反应来这一步骤，这一步骤容易受研究者自身主观因素影响。3) 不同研究者的模拟低温环境的实验器材不同也是造成差异性的原因。

本实验仍存在一定局限性，本实验通过逸蚴法选取活力较强的阴性钉螺，与自然界中的湖北钉螺种群相比应该更耐受低温，即样本性质与研究群体的特性存在差异[15],因此相比较得出的半数冬眠温度的结果可能要偏低。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.013

通讯作者：邹节新，Email:zoujx9@gmail.com

中图分类号：R383.2

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0061-04

Corresponding author:Zou Jie-xin, Email: zoujx9@gmail.com

收稿日期：2015-06-17；修回日期:2015-11-16

Differences on hibernating temperature between Oncomelania hupensis hupensis and O. h. robertsoni

RONG Da-wei1,WANG Liang1,WANG Yan2, 3,ZHOU Xian-min1,3,ZOU Jie-xin1,3

(1.DepartmentofParasitology,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;2.MedicalGeneticsandCellBiologyLaboratory,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3.KeyLaboratoryofPoyangLakeEnvironmentandResourceUtilizationSupportedbytheMinistryofEducation,NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

Abstract:To compare the differences of adaptability to low temperature between Oncomelania hupensis (O. h) hupensis and O. h. robertsoni, snails named O. h. hupensis and O. h. robertsoni were collected from areas of Xingzi County in Jiangxi Province, China(GPS: N 29°26′32″E 115°57′40″) and Tianquan County in Sichuan Province, China(GPS: N 30°06′36″E 102°52′52″), respectively. Oncomelania hupensis which were vibrant and negative in escaping cercariae test were chosen in our study. The two strains of snails were placed in artificial climate chamber and decreased to 0 ℃ with 1 ℃ / 2 day rate gradually beginning from 13 ℃, while detecting the hibernation rate and the death rate of two strains of snails at each temperature point. The same experiment settings were applied on O. h. hupensis in next summer. The ET50between two strains from two seasons were then compared. Results showed that the hibernation temperature of 50% O. h. robertsoni was 0.483℃(95% confidence interral from -0.440℃-1.332℃) and O. h. hupensis was 2.435 ℃(95% confidence interral from 1.695 ℃-3.146 ℃). No overlapping was detected between the 95% confidence interval of the two strains. However, there was a significant difference in the hibernating temperature within this range. But the hibernation temperature of 50% O. h. hupensis in summer was 2.046 ℃(95% confidence interval from1.331 ℃-2.745 ℃) and 2.780 ℃(95% confidence interval from 2.094 ℃-3.532 ℃) in winter. Overlapping existed in the 95% confidence interval of the two groups. There was no significant difference between the two hibernating temperature within this range. There is no statistically significant difference in the hibernating temperature of O. h. hupensis and O. h. robertsoni. There is no statistically significant difference in hibernating temperature of O. h. hupensis in summer and in winter.

Keywords:Oncomelania hupensis hupensis; O. h .robertsoni; hibernation rate; ET50

国家自然科学基金(No. 81160207,81260257,31460156)；国家级大学生创新创业训练计划(No.20140403047)