小麦dms突变体株高与赤霉素代谢的关系

于东艳，朱欣欣，李巧云，姜玉梅，牛吉山

(河南农业大学 国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450002)

小麦dms突变体株高与赤霉素代谢的关系

于东艳，朱欣欣，李巧云，姜玉梅，牛吉山*

(河南农业大学 国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450002)

为探究小麦dms突变体矮化的原因，用HPLC测定了大田植株发育过程中dms突变体矮株(D)、中等株(M)、高株(T)的茎秆赤霉素含量的变化；测量了喷施赤霉素后大田dms突变体株高的变化，并通过测量赤霉素处理后dms突变体幼苗胚芽鞘和第1叶长的长度变化，研究了dms突变体对赤霉素的敏感性。结果显示，D、M、T株对赤霉素的敏感时期和敏感浓度不同，总体来讲，T株敏感性最大，M株和D株次之；周麦18和T株幼苗的第1叶长度在200 μmol/L赤霉素处理下显著增加，M株的第1叶长对赤霉素响应不显著，周麦18幼苗的胚芽鞘长度在100 μmol/L赤霉素处理下显著增加，而T株和M株的胚芽鞘长度在各浓度赤霉素处理下均与空白对照无显著差异，D株在相同培养条件下生长迟缓，多数种子腐烂或出现胚芽鞘畸形，证明其对赤霉素敏感性差或者不敏感；在不同的生长时期，dms突变体D、M、T株的内源赤霉素含量都有很大变化，结合大田试验发现，D株在内源赤霉素含量最低的时期对外源赤霉素敏感，在内源赤霉素含量较高的时期对外源赤霉素不敏感，不能简单界定D株属于赤霉素缺陷型突变体或赤霉素不敏感型突变体。

小麦；dms突变体； 矮秆； 赤霉素

植物矮化突变体是基础理论研究与作物育种研究中很有价值的一类种质资源。引起植株矮化的原因有很多，最常见的是激素代谢途径的变异[1]。赤霉素是促进植物茎秆伸长的关键物质，许多小麦矮秆突变体是由于赤霉素合成或代谢途径产生障碍导致的。依据植株对赤霉素的反应，可把小麦矮化突变体分为赤霉素缺陷型和赤霉素不敏感型[2]。通过矮秆突变体对外源赤霉素的反应，以及测定分析茎秆快速伸长期赤霉素含量变化，能有效验证突变体的赤霉素代谢类型。发现较早的小麦矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b对外源赤霉素响应弱，属于赤霉素不敏感型基因[3]。最新研究发现，外源赤霉素能弥补小麦矮秆基因Rht12对小麦形态发育的影响，暗示Rht12突变体属于赤霉素合成缺陷型突变体[4]。前期报告了一个小麦新突变体dms，其典型特征之一就是植株矮化，节间长度也显著缩短[5]。但小麦dms突变体是否属于赤霉素合成缺陷或赤霉素不敏感型突变体还不清楚，因此，进行了dms突变体茎秆发育与赤霉素代谢间关系的研究，报道如下。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供试品种周麦18由周口市农业科学院提供。突变体dms由国家小麦工程技术研究中心实验室发现并保存，构建了自交系。dms突变体M株的后代分3种表型，高株(T，约0.8 m)、中等株(M，约0.6 m)和矮株(D，不足0.3 m)。形态观察显示，M株的每个节间缩短了20～50 mm，D株的节间数比T株和周麦18少2个，且其节间长度也显著缩短。T型植株后代不分离，但M型植株后代再次分离为T型、M型和D型植株，详见前期报告[5]。

1.2 试验方法

1.2.1 田间赤霉素处理 田间试验在河南农业大学荥阳农场进行。试验设置空白对照(CK1)和负对照(喷施0.003%多效唑,CK2)，赤霉素浓度分别设置50、100、150、200 μmol/L，共6个小区，每个小区长3 m、宽2.5 m。2014年10月10日将dms突变体M植株上收获的种子按行长2 m、行距 0.25 m进行播种。为防止药物挥发，相互影响，在处理之前将不同试验小区用塑料膜屏障隔开。在每个小区内随机选择D、M、T型植株各15株，编号、标记，在小麦拔节前(选择3月12日)以及3月25日到4月19日对标记植株进行赤霉素和多效唑喷施处理，其中3月25日之后每隔3～5 d喷一次，并于下一次喷施之前对标记的植株株高进行测量。

1.2.2 幼苗赤霉素处理 幼苗赤霉素处理参考郭保宏[6]的方法并加以改进。随机选取周麦18和dms突变体M植株后代的种子15粒，点播在铺有双层滤纸的9 cm培养皿中，每个种子位置固定并编序号。在温度20 ℃、黑暗条件下培养。赤霉素浓度设置0、15、50、100、150、200 μmol/L共6个梯度试验。种子萌动后，每天用棉签蘸取适量的赤霉素溶液涂抹在胚芽鞘上，待第1叶长出后用小喷壶喷施在第1叶上，喷至叶上水珠滴落为止。重复2次。待第1叶充分展开后(12 d左右，第2叶初露时)测量第1叶长度和胚芽鞘长度。试验结束后将全部幼苗连同茎部剪下，提取DNA，用SSR标记检测幼苗的基因型。鉴定幼苗为D、M、T型后，分别计算D、M、T型幼苗第1叶长和胚芽鞘长的平均值。

1.2.3 幼苗表型的SSR标记鉴定 由于不能从培养皿中的幼苗形态确定其成株时的表型，开发了SSR半定量鉴定方法。在严格控制PCR体系中DNA模板量时，T型株扩增产物是M株的2倍，D株无条带，以此判别籽粒的基因型。

以提取的幼苗基因组DNA为模板，用引物Xgwm95[7](上游序列：5′-GAT CAA ACA CAC ACC CCT CC-3′，下游序列：5′-AAT GCA AAG TGA AAA ACC CG-3′)进行定量PCR扩增。反应总体积10 μL，反应液组成为1 × PCR buffer(含Mg+)、200 μmol/L dNTP、每条引物0.2 μmol/L，DNA模板50 ng，1 UTaq聚合酶。扩增程序是95 ℃ 2 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行25个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、观察。

1.2.4 内源赤霉素含量的测定 从2015年3月29日至4月19日，每隔3～5 d在大田取D、M、T植株的幼茎最上节测量其内源赤霉素的含量。为了对比小麦拔节前的赤霉素含量，在3月15日取样一次调查赤霉素含量。将植株置于冰袋上运回实验室，剥取幼茎，在液氮中研磨成粉末状。提取方法参考Tang等[8]和Pan等[9]的方法：在10 mL离心管内加入1 mL 80%甲醇，称取质量；将样品粉末转移到装有冷甲醇的离心管中，再次称质量，2次称得的质量差即为样品质量；按照料液比1∶10补足甲醇，摇晃均匀，在4 ℃冰箱里避光浸提12 h，其间不时摇晃促进充分浸提；用灭菌的干净滤纸过滤提取液，用2 mL 80%甲醇洗涤滤渣，再次过滤；合并滤液，过C18固相萃取小柱(CleanertS C18，天津博纳艾杰尔公司)净化滤液；氮吹仪吹干，加80%甲醇定容至1 mL；过膜(0.22 μm)，Waters 2695高效色谱仪进行HPLC检测。

1.2.5 数据统计分析 所有株高、胚芽鞘长度和第1叶长的数据用Microsoft Excel和SPSS 17.0软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 赤霉素对dms突变体D、M和T型小麦株高的影响

不同时期D、M和T型植株的平均株高和显著性结果见表1。对比D、M、T株对赤霉素的敏感时期和敏感浓度发现，D株和T株都对赤霉素敏感的时期只有3月15日和4月15日，但在3月15日D株的赤霉素敏感浓度比T株高，且在茎发育中后期(3月29日—4月11日)对赤霉素不敏感，提示其对赤霉素敏感度不如T株。T株在200 μmol/L赤霉素处理下，在3月15日—4月19日，株高较空白对照或负对照都有显著提高。M株在4月3—7日对赤霉素不敏感，在3月29日和4月11—19日对赤霉素处理敏感，且敏感性都是较负对照多效唑处理而言，与空白对照并无显著差异，提示M株对赤霉素的敏感性不如T株。

虽然赤霉素能对D株和M株产生影响，但并未使D株和M株的株高接近T株，说明赤霉素并不能使dms突变体的株高发育恢复正常。

2.2 赤霉素对dms突变体第1叶长和胚芽鞘长度的影响

表2显示，周麦18种子的第1叶长在200 μmol/L赤霉素处理下比空白对照增加0.77 cm(6.6%)，达显著水平(P=0.036)，胚芽鞘长度在100 μmol/L的赤霉素浓度下比空白对照增加0.20 cm(6.4%)，达显著水平(P=0.018)；T株第1叶长在200 μmol/L赤霉素处理下比空白对照增加了0.90 cm(8.9%)，达到显著水平(P=0.020)，而T株和M株的胚芽鞘长度以及M株第1叶长对外源赤霉素均不敏感。以上数据表明，周麦18和T株种子对赤霉素处理敏感，M株敏感性在给出的处理浓度下敏感性相对较差；D株种子发育迟缓，多数籽粒出现胚芽鞘和第1叶畸形生长，5 d左右种子腐烂，喷施赤霉素没有促进其正常生长，表明其对赤霉素不敏感或敏感性差。

2.3 幼苗表型的SSR标记结果

SSR标记鉴定D、M、T型植株的电泳结果如图1所示。在严格控制PCR体系中DNA模板量时，T型株扩增产物是M株的2倍，T型株条带色深、带宽，M株条带色浅、带窄，D株无条带。

表1 不同时期多效唑和赤霉素处理下D、M、T株平均株高

注：*表示与空白对照的差异达0.05显著水平，§表示与负对照多效唑处理的差异达0.05显著水平。

表2 不同浓度赤霉素处理下dms突变体第1叶及胚芽鞘长度

注：*表示差异达到显著水平。D株幼苗不正常生长，后期多数种子腐烂，表中未列出。

m：Marker； T：T型植株； M：M型植株； D：D型植株

2.4dms突变体不同类型植株内源赤霉素含量变化

不同时期D、M、T株内源赤霉素含量变化见表3。在3月29日—4月3日，D、M、T株内源赤霉素含量较高，此时正值天气转暖，小麦茎秆处于快速生长期，但D株株高在3月29日和4月3日2个时期较空白对照或负对照并未显著增加，小麦拔节前(3月15日)D株内源赤霉素含量最低，但在外源赤霉素处理下株高较空白对照有显著提高。这可能由于D株对赤霉素的敏感性具有阶段性，也可能因为高浓度的赤霉素不利于D株的生长，这一点从4月15日D株内源赤霉素再次大幅降低，但在外源赤霉素处理下株高较空白对照有显著提高也可以说明。

表3 不同时期D、M、T株幼茎最上节平均赤霉素含量 μg/g

3 结论与讨论

在对小麦矮秆基因的报道中，株高性状都是通过测量小麦成熟后的株高得到的，如Chen等[4]研究发现，外源赤霉素能弥补小麦矮秆基因Rht12对小麦形态建成的影响。本研究在3月15日(小麦拔节前)，以及从3月19日小麦起身到4月中下旬小麦孕穗，调查了dms突变体D、M、T株小麦的株高变化以及不同时期对外源赤霉素的敏感情况，发现矮秆的D株只在3月15日和4月15日2个时期对赤霉素敏感，且这2个时期D株内源赤霉素含量最低。由此推测D株矮化可能有两方面原因：一方面，可能由于D株对赤霉素的敏感性具有阶段性，在茎发育期能大量合成赤霉素，但是与此同时D株对赤霉素不敏感，从而导致了株高变矮；另一方面，在3月29日—4月3日D株内源赤霉素增长幅度最大，但高浓度的赤霉素可能不利于D株的生长，导致了D株株高变矮。对dms幼苗做赤霉素处理的试验证明，D株和M株对赤霉素的敏感性不如T株。大田赤霉素喷施试验证明，各类型植株株高虽有所增加，但D株远未达到M株的水平，M株也远未达到T株的水平。

以上结果说明，dms突变体D株矮化的原因不能简单界定为对赤霉素不敏感或者赤霉素合成缺陷，其矮化的真正原因需要进一步研究。

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Relationship between Plant Height and GA Metabolism indmsMutant in Wheat

YU Dongyan,ZHU Xinxin,LI Qiaoyun,JIANG Yumei,NIU Jishan*

(National Engineering Research Center for Wheat/Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to explore the relationship between stem development and gibberellin metabolism indmsmutant in wheat,GA contents in the upper internodes ofdmswere determined by HPLC,the plant heights were measured after application of exogenous GA3in field; the length of coleoptiles and the first leaves were measured after application of exogenous GA3on the seeds ofdmsmutant and Zhoumai 18 in lab.The result showed that the sensitive period and concentration of dwarf(D),middle(M) and tall(T) plants to GA3were different.In general,the sensibility of T plants to GA3was the highest,followed by M and D plants.The lengths of the first leaves of Zhoumai 18 and T plants increased significantly after application of 200 μmol/L GA3,whereas there was no significant difference for M plants at any GA3concentration compared with control.The coleoptile length of Zhoumai 18 increased significantly after application of 100 μmol/L GA3,however,there was no significant difference for T and M plants at any GA3concentrations.The data of D plants were failed to get due to low seed vigour and abnormal development,which might be the consequence of poor GA3sensibility.The GA3content in the D,M,T plants ofdmsmutant fluctuated.Combined with the field experiment,it showed that the time when D plants were sensitive to exogenous GA3was exactly the period when its GA3content dropped to the lowest,whereas when D plant had a higher GA3concentration,it became insensitive to exogenous GA3.Thus,D plants ofdmsmutant could not be simply categorized as a GA biosynthesis deficient mutant or a GA insensitive mutant.

wheat;dmsmutant; dwarf; gibberellin

2015-11-24

国家“863”项目(2012AA101105)；国家自然科学基金项目(31571646)

于东艳(1991-)，女，河南信阳人，在读硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。E-mail：1039387135@qq.com

*通讯作者：牛吉山(1965-)，男，山西阳城人，研究员，博士生导师，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail：jsniu@263.net

S512.1

A

1004-3268(2016)05-0018-05