猪传染性胸膜肺炎放线杆菌磺胺类药物耐药基因的检测

李海利，邓祖丽颖，徐引弟，郎利敏，张青娴，游 一，王克领，冯亚杰，侯自花，白献晓*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州450002; 2.郑州幼儿师范高等专科学校，河南 郑州 450000)

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌磺胺类药物耐药基因的检测

李海利1，邓祖丽颖2，徐引弟1，郎利敏1，张青娴1，游 一1，王克领1，冯亚杰1，侯自花1，白献晓1*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州450002; 2.郑州幼儿师范高等专科学校，河南 郑州 450000)

为了解河南省及周边地区规模化猪场猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)对磺胺类药物的耐药情况，本研究从河南省及周边地区49个规模化猪场的肺脏和气管中分离出79株疑似APP菌株，血清型鉴定结果显示，分离菌株为1、2、3、5、7、8、9、10型APP，采用纸片扩散法对分离株进行了耐药表型鉴定，同时采用PCR方法对磺胺类药物耐药基因进行了检测。药敏试验结果显示，APP对磺胺类药物的耐药率为100%(79/79)。根据GenBank中登录的序列，设计了3对特异性引物，对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行扩增检测。耐药基因检测结果显示，分离的79株细菌中，Sul2基因检出率为100%(79/79)，Sul1基因的检出率为79.75%(63/79)，Sul3基因的检出率为89.87%(71/79)，Sul1和Sul2基因同时检出率为70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同时检出率为62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同时检出率为77.22%(61/79)。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌； 磺胺类药物； 耐药基因

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)是导致呼吸系统疾病的主要病原菌之一，已被国际公认为是危害养猪业的主要细菌性病原菌[1-3]。目前，养殖业逐步向规模化、集约化方向发展，中小养殖企业逐步退出市场，向大型、规模化的方向发展，养殖密度增大，应激因素增多，导致临床病例越来越复杂。近年来，临床抗生素的广泛应用及不合理使用，使细菌出现耐药性，导致多重耐药菌株和超级耐药细菌出现，给细菌病的防治带来了挑战[4-6]。目前，细菌耐药研究已成为全球公认的热点，欧美发达国家正在使用肽类制剂来替代抗生素[7-11]。

磺胺类药物是兽医临床常用药物，这类药物具有抗菌作用强、抗菌谱广、毒性小、口服易吸收等优点。部分革兰氏阳性菌如链球菌、葡萄球菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌和放线菌等，部分革兰氏阴性菌如沙门氏菌、大肠杆菌、变形菌、克雷白杆菌、肠道细菌等，立克次体和原生动物的弓形虫、球虫等对磺胺类药物敏感[12-13]。目前，兽医临床仍大量使用磺胺类药物。磺胺类药物可连续抑制叶酸途径中的酶，从而抑制细菌脱氧胸腺嘧啶的合成，阻断对氨基苯甲酸(PABA)向二氢叶酸(DFA)的转化[14-18]。对磺胺类药物产生耐药性的机制是出现了对磺胺类药物亲和力更低的新二氢叶酸合成酶，其由3个耐药基因编码，分别为Sul1、Sul2、Sul3，临床中主要是通过对这3个基因的检测来评价和反映磺胺类药物的耐药情况。目前，国内外有关APP耐药基因的研究报道较少，国内APP耐药现状和耐药流行分子特征也不清楚。为了解河南省及周边地区APP的流行情况和耐药情况，对从河南省及周边地区规模化猪场猪的肺脏和气管中分离的APP进行了鉴定和磺胺类药物敏感试验及耐药基因的扩增，旨在为今后APP的预防和治疗奠定基础，为临床用药提供参考，为控制耐药菌株的传播提供有力的手段。

1 材料和方法

1.1 菌株

从河南省及周边地区规模化猪场猪的肺脏和气管中分离的79株疑似APP菌株、支原体阴性对照菌株，由河南省农业科学院畜牧兽医研究所分离保存。

1.2 培养基及试剂

脑心浸液琼脂(含10%犊牛血清和100 μg/mL NAD)购于北京路桥生物技术有限公司。DL 2000 Marker、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 及相应的10×Buffer、dNTPs、细菌基因组DNA提取试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 APP的分离鉴定

1.3.1 分离纯化 将样品接种于脑心浸液琼脂(含10%犊牛血清和100 μg/mL的NAD)置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h，挑取特征菌落进行鉴定。

1.3.2 革兰氏染色镜检 挑取单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌的形态。

1.3.3 细菌生化试验鉴定 取单菌落接种于含1%NAD的各种细菌生化培养管(购于北京路桥生物技术有限公司)中，置于10%的CO2培养箱中培养24 h，观察反应结果。

1.3.4 细菌血清型鉴定 取纯培养的细菌，制备适宜含量的细菌悬液，与不同血清型APP标准阳性血清(购于中国兽医药品监察所)反应，进行平板凝集试验，观察凝集现象，确定分离菌的血清型。

1.4 药敏试验

采用K-B法进行磺胺类药物药敏试验，判定标准：根据抑菌圈大小(NCCLS2005)，抑菌圈≤10 mm为耐药，11～15 mm为中等耐药，≥16 mm为敏感。

1.5 细菌基因组提取及耐药基因的检测

1.5.1 细菌基因组DNA的提取 将每株细菌在脑心浸液琼脂平板上培养，5%CO2培养箱中37 ℃培养24 h。然后用灭菌接种环收集细菌，转入200 μL灭菌超纯水中。4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集沉淀，按照基因组提取试剂盒进行操作，提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.5.2 耐药基因的PCR检测 1.5.2.1 引物合成与设计 设计了3对特异性较高的引物，Sul1F：5′-GTGACGGTGTTCGGCATTCT-3′，Sul1R：5′-CTAACCTAGGGCTTTGGA-3′，预期扩增片段780 bp；Sul2F：5′-GAGCAAGATTTTTGGAATCG-3′，Sul2R：5′-TCCGAGAAGGTGATTGCGCT-3′，预期扩增片段720 bp；Sul3F：5′-TGTGCGGATGAAGTCAGCTC-3′，Sul3R：5′-CGGCATCGTCAACATAACCT-3′，预期扩增片段770 bp；上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.5.2.2 耐药基因的检测 PCR反应条件如下：体系为50 μL，Mg2+浓度为2.0 mmol/L，dNTPs浓度为0.15 mmol/L，TaqDNA聚合酶浓度为0.04 U/μL，引物浓度为0.3 μmol/L，DNA量为100 ng。

PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸 10 min。

1.5.2.3 扩增产物的检测及测序 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后进行回收，然后送宝生物工程(大连)有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 分离细菌培养特性观察

将分离的疑似APP菌株进行革兰氏染色，镜检可见细菌两极染色，菌体呈球状、杆状或球杆状等多形性(图1),与APP菌株形态一致。

图1 分离细菌形态特征

2.2 分离细菌生化试验鉴定结果

由表1可以看出，分离菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，不发酵乳糖、甘露醇、阿拉伯糖和七叶苷，不产生硫化氢和靛基质，尿素酶试验和过氧化氢酶试验呈阳性,与APP菌株的生化试验鉴定结果一致。

表1 细菌生化鉴定结果

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。

2.3 分离细菌血清型鉴定结果

细菌的纯培养物分别与1型—12型APP标准阳性血清进行平板凝集试验，结果显示，分离到的部分菌株能与标准型阳性血清呈现明显的凝集现象，与其他标准阳性血清和生理盐水对照均不发生凝集反应。血清型鉴定结果表明，分离到的菌株为APP血清1型、2型、3型、5型、7型、8型、9型和10型。

2.4 分离细菌药敏试验结果

由表2可以看出，分离细菌对磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(SMZ-TMP)的耐药率均为100%。

表2 分离细菌药敏试验结果 mm

2.5 分离细菌耐药基因检测结果

对分离细菌耐药基因检测结果显示，分离的79株菌株均检测出了磺胺类药物耐药基因，其中，Sul2基因检出率为100%(79/79)，Sul1基因的检出率为79.75%(63/79)，Sul3基因的检出率为89.87%(71/79)，Sul1和Sul2基因同时检测出率为70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同时检出率为62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同时检出率为77.22%(61/79)。部分检测结果的电泳图谱见图2—图4。

可见，79株分离细菌的药敏试验结果和耐药基因PCR检测结果一致，均为100%。

图2 Sul1基因检测结果

图3 Sul2基因检测结果

图4 Sul3基因检测结果

3 讨论

细菌耐药性已成为全球关注的焦点，大多数临床分离细菌呈现多重耐药，甚至出现超级耐药菌株。这与临床不合理用药有关[19-21]。磺胺类药物是临床常用的一类药物，在养猪生产中作为饲料添加剂被广泛应用，有的超量添加使用，造成细菌对这类药物的抗药性增加，甚至出现普遍耐药。其原因可能是通过质粒转移或酶突变产生，包括二氢叶酸合成酶与磺胺的亲和力降低，细菌对磺胺的通透性降低，以及细菌改变了代谢途径，如产生了较多的对氨基苯甲酸或二氢叶酸合成酶[22-25]。

APP有2个生物类型，生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型的生长需要NAD，生物Ⅱ的生长不需要NAD。APP共有15个血清型，我国流行的主要是血清1型、2型、3型、5型、7型、9型和10型。APP抗原主要是荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、溶血素、黏附素等抗原。不同血清型之间抗原差异比较大，血清1型、5型、9型、10型和11型毒力较强，常见于严重暴发、高死亡率和严重的肺纤维素化病变的病料中。由于抗原差异较大及各血清型之间交叉保护低，导致临床用疫苗不能提供完全保护，因此要有针对性地选用疫苗。当猪场感染发病时，应先分离细菌确定血清型及药物敏感性才能产生较好疗效。

本研究分离的79株APP对磺胺类药物普遍产生了耐药性，耐药率高达100%。其中，Sul2基因的检出率最高，为100%(79/79)，Sul1基因的检出率为79.75%(63/79)，Sul3基因的检出率为89.87%(71/79)。Sul1和Sul2基因同时检测出率为70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同时检出率为62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同时检出率为77.22%(61/79)。Sul1基因的检出率低于Sul2和Sul3。

对APP防治的重点在于血清学监测、细菌分离及血清学鉴定和药敏试验，猪场一旦发病，应采取严格的净化措施。建立无APP的净化猪群，采用多种监测手段进行检测。临床上要合理用药，避免耐药菌株的产生，并且按疗程用药，长期给药会造成病原菌的抗药性及肉制品的药物残留。此外，采用相应血清型的疫苗免疫接种仍然是预防和控制APP流行的有效措施。

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Detection of Sulfonamides Resistant Genes in Porcine ContagiousActinobacilluspleuropneumoniaeIsolated from Pigs

LI Haili1,DENGZU Liying2,XU Yindi1,LANG Limin1,ZHANG Qingxian1,YOU Yi1,WANG Keling1,FENG Yajie1,HOU Zihua1,BAI Xianxiao1*

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

In order to understand the scale of swine infectiousActinobacilluspleuropneumoniae(APP) resistant to sulfonamides in Henan province and neighboring regions.A drug sensitivity test was carried out in 79Actinobacilluspleuropneumoniaestrains isolated from lung and trachea pigs from 49 large scale pig farms in Henan province and neighboring regions.Serotype identification results showed that isolates were 1,2,3,5,7,8,9,10.Antimicrobial susceptibility disk method of isolates were used in resistant phenotype identification.At the same time,the PCR method was used for detection of sulfonamides resistance genes.Drug sensitivity test results showed that the sulfonamides resistance rates of the isolates from pigs were 100%(79/79).Sulfonamides resistant genesSul1,Sul2 andSul3 were detected by PCR with three pairs of specific primers designed according to the sequence available in GenBank.Among the 79 strains,the detection rate ofSul2 was the highest,which was 100%(79/79),the detection rate ofSul1 gene was 79.75%(63/79),and the detection rate ofSul3 gene was 89.87%(71/79).TheSul1 andSul2 genes were detected at the same time of 70.89%(56/79),Sul1 andSul3 were 62.03%(49/79),Sul2 andSul3 were 77.22%(61/79).

Actinobacilluspleuropneumoniae; sulfonamides; resistant genes

2015-12-10

河南省农业科学院自主创新基金(20151126)

李海利(1982-)，男，河南开封人，助理研究员，博士，主要从事动物传染病临床诊断及防控研究。 E-mail:haili8693@sina.com

*通讯作者：白献晓(1963-)，男，河南南阳人，研究员，主要从事畜牧技术经济、食品安全研究以及畜牧技术示范推广工作。E-mail:bxx388@sina.com

S855.1

A

1004-3268(2016)05-0135-05