雪莲十味片总黄酮提取工艺研究

苏　苗　红　梅　阿拉腾敖日格勒　包勒朝鲁

(内蒙古医科大学蒙医药研究院，呼和浩特，010110)



雪莲十味片总黄酮提取工艺研究

苏苗红梅阿拉腾敖日格勒包勒朝鲁

(内蒙古医科大学蒙医药研究院，呼和浩特，010110)

摘要目的：研究雪莲十味片总黄酮的超声提取工艺。方法：以总黄酮含量为考察指标，采用正交实验筛选出雪莲十味片提取总黄酮最佳路线，以芦丁为对照品，紫外可见分光光度法测定复方片总黄酮的含量。结果：雪莲十味片总黄酮提取最佳方法为75%的乙醇溶液，在55 ℃下，超声提取50 min。平均提取量12.27 mg/g。结论：优选出的最佳工艺简单易行，能够大大提高雪莲十味片的总黄酮提取率。

关键词雪莲十味片；总黄酮；正交实验；紫外分光光度法

雪莲十味片为蒙医传统验方，由苞叶雪莲花、甘青乌头、红花等10味药组成，具有清瘟解热、止痛之功效，主要用于疼痛性亚甲炎、扁桃体炎、上呼吸道感染等。本研究旨在测定复方中主要活性成分总黄酮的含量，实验以黄酮类化合物为考察指标，采用正交实验优化雪莲十味片中总黄酮提取方法，并进行了含量测定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；JA5003N型电子分析天平(上海菁海仪器有限公司)；HH-S8电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；DFT-200万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KQ250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2药材雪莲十味片：从市场购置苞叶雪莲、红花、甘青乌头等10味药材，经蒙医药研究院那生桑教授鉴定均为真品后，粉碎过30目筛，按处方比例进行混合制粒，压片即可。

1.1.3试剂芦丁对照品(BR含量≥98%，购于中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707)；石油醚(天津永晟精细化工有限公司，批号：20130125)；乙醇(天津市化学试剂三厂，批号：20130120)；亚硝酸钠(天津市盛富江化工销售有限公司，批号：20050405)；氢氧化钠(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20101020)；硝酸铝(天津市博迪化工有限公司，批号：20050518)等。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品20.75 mg，置于100 mL容量瓶中，用75%乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀,得浓度为0.207 5 mg·mL-1的芦丁标准溶液,备用。

1.2.2供试品溶液的制备精密称取样品约1.05 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL石油醚，加热回流1 h。弃去石油醚，挥干溶剂，加入10倍量75%乙醇溶液，超声提取30 min[1-2]，冷却，抽滤，弃去药渣，滤液置于50 mL容量瓶中，加入75%乙醇溶液将其定容，并作为样品溶液备用。

1.2.3测定波长的选择分别吸取对照品溶液、供试品溶液各2 mL，置于25 mL的容量瓶中。各加75%乙醇至7 mL、5%NaNO2溶液1 mL后放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀静置6 min,加4%的NaOH溶液10 mL,最后用75%乙醇溶液定容至刻度，密塞，摇匀放置15 min[3]，用紫外可见分光光度法，扫描图谱(200～800 nm)，在510 nm处有较强吸收。因此选择510 nm作为测定波长。

1.2.4绘制标准曲线[4]精密吸取上述配置对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加75%乙醇至7 mL 5%NaNO2溶液1 mL,放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀静置6 min,加4%的NaOH溶液10 mL,最后用75%乙醇溶液定容至刻度，密塞，摇匀，放置15 min后，以相应的空白为参比，在510 nm处测定吸光度,并以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.012 3C-0.001 6(r=0.999 9)，表明对照品溶液在8.30～41.5 μg·mL-1范围内与吸光度值之间呈良好线性关系。

1.2.5样品含量测定精密吸取样品溶液约2.0 mL，按“1.2.4”项下方法显色，测定吸光度,计算总黄酮浓度。

2结果

2.1方法学考察

2.1.1精密度试验[5]精密吸取上述对照品溶液2.0 mL，按“1.2.4”项下方法显色，测定吸光度，连续测定6次，结果吸光度测量值RSD为0.82%(n=6)，可表明仪器精密度良好。

2.1.2稳定性试验[6]取样品溶液，按“1.2.4”项下方法显色，每隔1 h测定吸光度，结果吸光度测量值RSD=1.41%(n=4)，可表明，供试品溶液在4 h内稳定，稳定性良好。

2.1.3重复性试验[7]精密称取同一批样品粉末6份，按“1.2.2”和“1.2.4”项下方法提取和显色，测定吸光度并计算，结果总黄酮以芦丁计算，平均含量为(12.33 mg·g-1)，RSD为1.33%(n=6)，表明本方法重现性良好。

2.1.4加样回收率试验[8]精密称取同一批样品粉末6份，分别精密加入对照品，按照“1.2.2”和“1.2.4”项下方法提取和显色，测得吸光度并计算，结果平均回收率为101.3%，RSD为2.99%(见表1)，表明本方法准确可靠。

表1　总黄酮加样回收率

2.2正交实验考察根据雪莲十味片中各味药的理化性质及主要药效，结合单因素实验结果，选择乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)3个因素，以芦丁含量为评价指标，采用L9(34)正交表安排实验，因素水平表见表2，正交实验结果见表3、表4。

表2　因素水平表

表3　正交实验结果

表4　方差分析

注：F(0.05)=19.0。

从表3中可知以总黄酮为指标的最佳条件为A2B3C3，影响次序为A>C>B。从表4中可知三个因素中乙醇浓度对总黄酮含量有统计学意义(P<0.05)，提取时间和提取温度则无统计学意义(P>0.05)。综上，雪莲十味片最佳提取条件为乙醇浓度75%，提取时间50 min，提取温度55 ℃。

2.3最佳提取工艺条件的验证实验精密称取不同批次雪莲十味片3份，每份约1.05 g，石油醚脱脂，按最佳提取条件A2B3C3平行操作，按“1.2.4”项下方法显色，测得吸光度并计算，结果见表5，总黄酮平均含量为12.27 mg·g-1，RSD为0.9652%。

表5　总黄酮含量测定结果

3讨论

亚急性甲状腺炎(Subacute Thyroiditis，SAT)，是临床常见的甲状腺疼痛性疾病[9]，多见于30～50岁的女性，是男性的3～6倍。发病有季节性，冬、春季节是其发病的高峰。初期有上呼吸道感染症状，如发热，寒战、疲乏无力、食欲不振，续而出现甲状腺部位的疼痛和压痛常向颌下、耳后或颈部等处放射，咀嚼和吞咽时疼痛加重。临床上常予以非甾体类抗炎药、糖皮质激素治疗，同时适时给予甲状腺素缓解甲状腺功能减低[10-14]。这些药物均有不同程度的不良反应。

雪莲十味片为蒙医传统验方，临床应用多年，对治疗疼痛性亚甲炎、扁桃体炎、上呼吸道感染等疗效显著，不良反应较少，临床疗效显著。其君药苞叶雪莲花为菊科植物苞叶雪莲SaussureaObvallata(DC.)-Bip.的干燥地上部分，主要活性成分为黄酮类化合物[15-19]，大量实验表明黄酮类等生物活性成分有抗癌作用，抗氧化清除自由基，抗炎，抗菌抗病毒作用[20]。本实验对雪莲十味片中的总黄酮的提取方法进行了考察，并对其含量进行测定，实验结果表明雪莲十味片的总黄酮提取最佳工艺条件为使用石油醚脱脂后加入10倍量75%乙醇溶液，温度为55 ℃下超声提取50 min。此提取方法不仅工艺简便快捷，还能提高雪莲十味片的总黄酮提取率，为雪莲十味片的深入研究和开发应用提供参考依据。

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(2015-09-15收稿责任编辑：张文婷)

Study on the Extraction of Total Flavonoids in Xuelian Shiwei Tablets

Su Miao,Hong Mei,Alatan Aorigele,Bao Lechaolu

(MongolianMedicineResearchInstituteofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China)

AbstractObjective:To study the ultrasonic extraction process of total flavonoids in Xuelian Shiwei tablet.Methods:Taking the total content of flavonoids as the detect index,and the orthogonal experiment design was adopted to investigate the best route for extracting the total flavonoids from Xuelian Shiwei tablets.Taking rutin as reference,and ultraviolet spectrophotometry was applied to determine the content of flavornoids.Results:The best method of extraction is 75% ethanol as solvent,at 55 ℃,for 50 mins under ultrasonic.The average extraction volume was 1.287 mg/g.Conclusion:This method is easy to operate,and can enhance the extraction rate in a large deal.

Key WordsXuelian Shiwei tablets; Total flavonoids; Orthogonal experiment; Ultraviolet spectrophotometry

基金项目：内蒙古自治区蒙中药重点实验室提升计划项目资助课题(编号：20090902)

作者简介：苏苗(1989.8—)，女，内蒙古包头市人，内蒙古医科大学在读研究生，研究方向：药理学，E-mail：15148039326@139.com 通信作者：包勒朝鲁(1976.10—)，男，内蒙古锡林郭勒盟人，讲师，硕士研究生，研究方向：蒙医方剂剂型改革与安全性评价，Tel：(0471)6653173，E-mail：956613769@qq.com

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.041