扶正消癌Ⅰ号方对小鼠肠癌肝转移血管内皮生长因子的表达的影响

张艳丽　张红卫　杜　鹃　侯安继,3

(1 上海市第七人民医院肿瘤科，上海，200137； 2 第二军医大学附属长海医院中心实验室，上海，200137；3 上海市徐汇区中心医院肿瘤科，上海，200137)



扶正消癌Ⅰ号方对小鼠肠癌肝转移血管内皮生长因子的表达的影响

张艳丽1张红卫1杜鹃2侯安继1,3

(1 上海市第七人民医院肿瘤科，上海，200137； 2 第二军医大学附属长海医院中心实验室，上海，200137；3 上海市徐汇区中心医院肿瘤科，上海，200137)

摘要目的：观察自拟扶正消癌Ⅰ号方对balbc小鼠移植瘤血管内皮生长因子(VEGF)表达的作用，探讨该方对多种肿瘤的作用机制。方法：采用balbc小鼠，脾下注射法建立鼠大肠癌细胞株肝转移的动物模型，随机分为4组，每组12只：1)阴性对照生理盐水组；2)氟尿嘧啶组；3)扶正消癌I号方中药组；4)扶正消癌I号中药+氟尿嘧啶组。观察生活质量，抑瘤率，免疫组化方法检测VEGF蛋白表达的情况。结果：扶正消癌I号方+氟尿嘧啶组、消癌I方组小鼠的生活质量较其他2组好，阴性对照组瘤体最大，瘤体中药组其次，联合用药组体积最小，氟尿嘧啶组、中药组及联合用药组均能下调VEGF蛋白的表达。结论：扶正消癌Ⅰ号方对鼠大肠癌细胞株肝转移小鼠抑制新生血管的作用机制可能是通过下调VEGF的表达，抑制肿瘤微血管生成，可能是该方抗肿瘤的机制之一。

关键词中医药；血管生成；血管内皮生长因子

随着人类饮食生活水平的提高和生活水平的改变，结直肠癌的发病率逐年增加，给社会带来了巨大的负担。大肠癌其5年生存率仍不高，主要原因是肿瘤的转移和复发，近些年来肿瘤新生血管生成是研究热点，实体肿瘤的生长、侵袭和转移都依赖于肿瘤血管的生成。以益气扶正[1]为根本大法是大肠癌防治中最常用的治疗手段之一，氟尿嘧啶以抗代谢物而起作用，干扰DNA、RNA合成而组织肿瘤细胞的合成。本研究利用鼠大肠癌细胞株肝转移的Bablc小鼠模型，探讨扶正消癌I号联合氟尿嘧啶对荷瘤小鼠血管生长的抑制作用与机制。

1材料

1.1实验动物清洁级Balb/c小鼠48只，雌雄各半，体质量(20+2)g，由第二军医大学，长海医院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0003，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2007-0003。分笼饲养，适应环境3 d后开始实验。

1.2实验药物扶正消癌I号方(由上海市第七人民医院中药房提供，每毫升含生药2.8 g，相当于人用量的5倍)，密封，4 ℃保存，临用前配置。氟尿嘧啶(5-Fu)(上海旭东海普药业有限公司生产，生产批号：FA140418，规格：10 mL∶0.25 g)。小鼠大肠癌细胞株CT26.WT细胞，ATCC公司提供。RPMI1640，Sigma提供，小牛血清，杭州四季青公司提供。EnVision试剂(HRP/Rabbit and mouse)(货号：K500711 kit，丹麦Dako)

2实验方法

2.1造模方法本研究参考国内外文献，用脾脏注射法建立小鼠大肠癌细胞株(CT26)肝转移模型[2]。常规培养小鼠大肠癌细胞株CT26，接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基，置于37 ℃、50 mL/L CO2恒温箱中培养。于对数生长期细胞，用生理盐水，制成5×107细胞/mL浓度的细胞悬液，取50 L接种于4～6周龄雌性Balb/c小鼠脾被膜下。在注射部位可见脾被膜发白、肿胀，拔出针头，立即止血按压，约3 min，观察无出血后，把脾脏送回腹腔内，关腹。严格无菌操作。术后继续在SPF条件下饲养。

2.2分组与给药方案

2.2.1分组当小鼠肝脏部位出现约0.5 cm直径大小瘤体时编号，采用数字表法随机分为4组，即扶正消癌I号中药方(简称消癌I方)+氟尿嘧啶组、消癌I方组、氟尿嘧啶及阴性对照生理盐水组，每组12只均置于SPF环境下饲养。

2.2.2给药方案1)阴性对照生理盐水组：生理盐水，1.5 mL/只，1次/d，灌胃，连续给药2周；2)氟尿嘧啶组(20 mg/kg)，1.5 mL/只，每隔2 d给药1次，腹腔注射，连续给药2周；3)扶正消癌I号方中药组，中药方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃，连续给药2周；4)扶正消癌I号中药+氟尿嘧啶组：中药方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃；氟尿嘧啶(20 mg/kg)，每隔2 d给药1次，腹腔注射，连续给药2周。上述治疗组均于随机分组当日起给药；饲料、饮水自由。

2.3标本提取第15天处死。严格无菌操作取瘤重W，清除部分坏死和纤维结缔组织，取一小块组织管，-80 ℃液氮冷冻保存，10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋的残留组织，连续4 mm切片，免疫组化检测。每组2例。免疫组化法检测血管内皮生长因子的表达。濒死小鼠及时处死解剖，瘤组织切取和保存方法同前。

2.4检测指标

2.4.1观察小鼠每天的饮食、水，体重，活动度，毛发光泽度及精神状况。

2.4.2瘤重、抑瘤率建模治疗后，观察抗肿瘤效果，每隔3 d用游标卡尺测量肿瘤最大直径和横向尺寸的估计量，平均各组，绘制生长曲线：1/2(直径×宽度)。第15天称重，脱颈处死小鼠，并在无菌操作下取出肿瘤组织，并迅速称重W。每组2例肝肿瘤。计算实体肿瘤生长抑制率(IR)：IR(%)=(1一治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

2.4.3免疫组化法检测VEGF蛋白表达采用Envision免疫组化染色法。在普通显微镜下观察并摄片。操作步骤参照说明书：每个肿瘤组织切片常规脱蜡，在高温柠檬酸抗原修复后，加3%过氧化氢，用PBS洗涤，滴VEGF抗体1∶100(50 μL/组织块)，4 ℃过夜，用PBS洗涤，二抗37 ℃孵育，DAB显色，复染，脱水，封片。阳性细胞细胞质呈棕黄色颗粒。参考刘曼曼等检测方法[3]，先在低倍镜下(100)，阳性染色最密集的区域，然后在400次从5个随机选择的视觉范围，输入的显微图像分析系统(leica QV3系统)，染色强度的变化的阳性细胞作为定量指标，计算平均灰度值的阳性表达水平，灰度值越小，阳性表达水平愈高，反之亦然。

3结果

3.1一般情况各组小鼠用药期间活动性表现差异明显。在整个过程中，氟尿嘧啶组有小鼠因一般情况较差，有2只未完成实验。其中生理盐水组小鼠瘤体增长最大，进食量明显减少，小鼠精神状态较差，活动度减少，随时间延长，其明显消瘦，消癌I方组小鼠虽然瘤体大，但是摄食、饮水量、精神状态较其他组明显好。消癌I方组、氟尿嘧啶组、联合用药组体重较生理盐水组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而各用药组体重差异无统计学意义。

3.2瘤重、抑瘤率初期各组小鼠肿瘤体积均随着时间推移呈现增长趋势，阴性对照组>消癌I方组>氟尿嘧啶组>联合用药组(见表1)。用药组中，联合用药组小鼠的瘤体生长速度较其他组慢，单纯中药组、中药和氟尿嘧啶联合用药组其瘤体生长速度最快，但小鼠生活精神状态较其他用药组改善，随着时间延长，氟尿嘧啶组和联合用药组均出现缩小趋势，但均未出现肿瘤消失情况。抑瘤率分别为中药组59.83%，氟尿嘧啶组73.68%，联合用药组84.48%(见表2)。各用药组与对照组瘤体治疗差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1　各组小鼠种植瘤的生长情况

表2　各组药物对小鼠移植瘤的抑制作用

注：与阴性对照组比较：**P<0.01。

表3　各组对肠癌CT26细胞小鼠移植瘤VEGF的蛋白表达水平的影响±s)

注：与阴性对照组比较：**P<0.01，*P<0.05。

图1　免疫组化检测荷瘤组织中VEGF表达

注：A:生理盐水阴性对照组，光学显微镜(×40)；B：消癌I方组，光学显微镜(×40)；C：氟尿嘧啶组，光学显微镜(×40)；D：中药+氟尿嘧啶组，光学显微镜(×40)。

3.3对VEGF蛋白表达的影响阳性细胞细胞质呈棕黄色颗粒。本实验的结果表明，与生理盐水阴性组比较，联合用药组、消癌I方组、氟尿嘧啶组治疗均可降低VEGF蛋白的表达，差异均有统计学意义(P<0.01)，与氟尿嘧啶组比较，虽然中药组VEGF表达无统计学意义(P>0.05),但有减少的趋势。统计分析表明，消癌I方组单独或联合氟尿嘧啶，均可显著抑制荷瘤瘤体VEGF的表达。(见表3，图1)

4讨论

现代医学研究表明，在1971年，Folkman等[4]人首次发现肿瘤的生长依赖于肿瘤组织的血管生成。如果没有营养支持，肿瘤不能超过1～2 mm3。新生血管是肿瘤生长和转移的必备条件，血管内皮细胞具有低突变性、稳定遗传性，抗血管生成、抑制血管内皮生长因子直接针对肿瘤血管内皮细胞。许多恶性肿瘤细胞VEGF的自分泌作用，促进局部血管的形成。血管内皮生长因子是最重要的促血管生成因子，直接促进内皮细胞的增殖，促进新生血管的形成[4-5]。结直肠癌患者血清中，VEGF、MVD与预后相关，可作为检测大肠癌预后的参考指标[6]。近年来，血管内皮生长因子是抗血管生成治疗的重要靶点，已成为一个热门话题，从而引起科学家们的关注[7]。贝伐单抗(BEV)通过直接阻断VEGF抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤血管的生长[9-10]。但目前大多数文献通过临床组织标本和体外实验细胞的检测，探讨与肿瘤血管生成的关系，中药复方[11-14]以健脾补气行气、活血化瘀法见多。针对目前很多不能耐受化疗的患者，中医学在这方便发挥了极大的优势。我们从临床观察中肿瘤晚期患者服用补气活血化瘀中药后[15-17]能明显提高其近期疗效和改善生活质量。扶正抗癌I号方是上海市第七人民医院肿瘤科治疗肠癌的长期经验总结，全方组成黄芪15 g，太子参15 g，茯苓10 g，白术10 g，山药10 g，白花蛇舌草30 g，藤梨根15 g，山慈菇15 g，蜈蚣2条等组成，处方中以扶正益气之黄芪、太子参、茯苓、白术等为君，攻伐抗癌之白花蛇舌草、山慈菇等为臣，佐以藤梨根、蜈蚣等，使以甘草，全方共奏扶正抗癌之效。前期临床观察中能明显改善晚期肿瘤患者的生活质量[18-19]，我们的实验结果发现，消癌I方组、氟尿嘧啶组、联合瘤体均有减小，各用药组中，中药组瘤体质量最大，但生活质量较氟尿嘧啶组一般情况好，说明扶正益气为主的重要能对改善生活质量起到一定作用。联合用药组、消癌I方组、氟尿嘧啶组治疗均可降低VEGF蛋白的表达，差异均有统计学意义(P<0.01)，与氟尿嘧啶组比较，虽然单纯消癌I方中药组VEGF表达无统计学意义(P>0.05)，但有减少的趋势。扶正消癌I号方、氟尿嘧啶及联合用药均可明显抑制大肠癌细胞株CT26移植瘤的生长，因此，我们认为，消癌I号联合氟尿嘧啶在荷瘤鼠体内均具有抗血管生成作用。消癌I号方抗血管生成可能是通过下调VEGF的表达间接抑制肿瘤血管形成，直接作用于血管内皮细胞，抑制肿瘤组织生长。

参考文献

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(2015-07-12收稿责任编辑：张文婷)

Effect of Fuzheng Xiaoai I Decoction on the Expression of VEGF in the Liver Metastasis of Colon Cancer Mice

Zhang Yanli1, Zhang Hongwei1, Du Juan2, Hou Anji1,3

(1OncologyDepartmentoftheSeventhPeople'sHospitalofShanghai,Shanghai200137,China; 2CenterLaboratoryofChanghaiHospitalaffiliatedtoSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200137,China;3OncologyDepartmentofCenterHospitalofXuhuiDistrict,Shanghai200137,China)

AbstractObjective:To investigate the effect of Fuzheng Xiaoai I decoction on VEGF expression of mice with liver metastasis of colon cancer, and discuss its possible mechanism.Methods:The tumor models were established by injecting human carcinoma of CT26 cells under the balbc mice. Balbc mice with liver cancer cells are randomized divided into 4 groups (12 in each group): 1)Control group; 2)5-Fu group; 3)Fuzheng Xiaoai I group; 4)Fuzheng xiaoai I+5-Fu group. The life quality of mice, tumor inhibiting rates, and the expression of VEGF in tumor tissue were measured.Results:The life quality of group 4 and 3 are better than that of the other groups. Besides, the tumor size of group 4 was the smallest, and that of the control group was the biggest. The levels of VEGF in all groups were decreased.Conclusion:Fuzheng Xiaoai I could inhibit the angiogenesis of tumor possibly by down regulating VEGF and obstructing the formation of tumor vessels.

Key WordsTraditional Chinese medicine; Angiogenesis; VEGF

基金项目：上海市卫生局中医药科研基金项目(编号：2012QJ006B)，上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目(编号：PWZxq2014-12)，上海市第七人民医院“七院新星”培养计划(编号：qyxx-2012-26)

作者简介：张艳丽(1983.04—)，女，硕士研究生，主治医师，研究方向：中西医结合肿瘤防治，Tel：(021)58670561-6340，E-mail：yanly_zhang@163.com 通信作者：侯安继(1964.12—)，男，博士研究生，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合消化道肿瘤临床和实验研究，Tel：(021)58670561-6337，E-mail：anjihou@163.com

中图分类号：R289.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.035