线粒体应激蛋白在脑缺血再灌注损伤中的表达及意义

刘思言,毛　颖,姜现瑞,马鹤铭,王心雪,孙连坤,康劲松*

(1.吉林大学临床医学院，吉林 长春130021;2.吉林大学 病理生理学系,吉林 长春130021)



线粒体应激蛋白在脑缺血再灌注损伤中的表达及意义

刘思言1,毛颖2,姜现瑞2,马鹤铭1,王心雪2,孙连坤2,康劲松2*

(1.吉林大学临床医学院，吉林 长春130021;2.吉林大学 病理生理学系,吉林 长春130021)

脑缺血半暗带区是指由于脑缺血所致的脑细胞点活动停止，功能丧失但形态结构仍然保持完整的组织，位于严重缺血中心区中卫的低灌注区，具有可逆性及可变性，可转化为正常灌注区或梗死区[1]。大量动物实验表明，缺血灶的中心区域以神经元的坏死为主而缺血半暗带区以凋亡为主[2,3]。但最新的研究表明，在线粒体应激中，线粒体中非折叠蛋白的增加远早于细胞凋亡[4]，线粒体非折叠蛋白的增加是其产生毒性作用前的一个广泛存在的应激反应，并可剥夺细胞能量、控制细胞死亡[5]。目前尚未见线粒体应激相关蛋白与不同脑缺血程度关系的报道。

因此，本研究的目的通过线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型，在此基础上检测脑缺血灌注损伤后不同时间点缺血半暗带线粒体应激相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达，探讨线粒体应激在脑缺血再灌注损伤过程中的作用，为脑缺血再灌注损伤中的半暗带形成及调控提供理论依据和新的作用靶点。

1材料与方法

1.1实验动物

Wistar大白鼠，雄性，体重250-300 g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心，合格证号：SYXK(吉)2013-0003。取大鼠40只，随机分成4组，每组10只。分别为假手术对照组，缺血1 h再灌24 h组(1 h)，缺血1.5 h再灌24 h组(1.5 h)，缺血3 h再灌24 h组(3 h)。

1.2主要试剂与仪器

ClpP、cleaved-caspase3、β-actin抗体购自美国Santa cruz公司，二抗购自美国 Pierce 公司。ECL发光试剂盒购自上海碧云天公司。化学发光显影系统购自英国 Synene 公司；-80℃低温冰箱由日本SANYO公司生产。

1.3大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型的制备

利用本室常规方法制备大鼠MCAO模型[6]，根据不同缺血时间在相对应时间后将大鼠颅内的线栓拔出，恢复血流进行再灌注，时间为24 h。假手术组，线栓不插入颅内，其余操作同上。以动物清醒后爬行时右转圈,提尾时右前肢内收屈曲为入选标准。24 h后断头处死各组动物，迅速分离半暗带大脑皮质[7]，液氮冻存备用。

1.4HE染色

24 h后用10%水合氯醛将其麻醉，将胸廓剪开，暴露心脏，把灌注针头经左心室刺入至主动脉，用止血钳加以固定，然后剪开右心房，先用生理盐水对其进行快速灌注冲洗直至肝脏变白，然后用4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)对其进行灌注固定，最后将大鼠断头，取出完整大脑，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h。用常规方法经过脱水、透明、包埋和切片制作石蜡切片，接着进行HE染色，封片，光镜下进行观察。

1.5Western Blot检测脑组织应激相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达

按1 ml/100 mg的量加入组织裂解液，提取大脑皮层总蛋白。采用Bio-Rad法测定蛋白浓度，取30 μg上样，配制12%聚丙烯酰胺凝胶，采用恒压100V跑电泳，并用恒压100V将蛋白转至PVDF膜，之后用10%脱脂奶粉室温封闭1 h，用兔源的ClpP、cleaved-caspase3及内参蛋白β-actin多克隆抗体作为一抗，4℃封闭过夜。隔天用含吐温的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；之后加山羊抗兔二抗，在摇床室温封闭孵育2 h，TBST再一次洗膜3次，每次10 min，最后用ECL发光液冲洗，在化学发光显影系统中进行显色，并做灰度值分析。

1.6统计学处理

2结果

2.1局造性脑缺血对大鼠脑皮质损伤的影响

大鼠大脑HE染色结果表明，脑缺血1 h再灌注24 h，缺血侧大脑皮质出现典型的红色样变神经元，表现为细胞核固缩，胞体缩小变形，胞浆呈深伊红色；缺血1.5 h再灌注24 h，缺血侧大脑皮质浓染细胞明显增多，细胞周围间隙增宽，脑组织结构稀疏；缺血3 h再灌24 h，脑缺血侧大脑神经细胞发生核溶解，核消失，脑组织结构更加稀疏，正常神经结构消失。说明随着缺血时间延长脑损伤加重且脑梗死面积变大。

图1　大鼠脑皮质组织病理学改变

2.2局造性脑缺血对线粒体应激蛋白及凋亡相关关蛋白表达的影响

Westernblot结果表明，凋亡蛋白cleaved-caspase3随着缺血时间的延长，表达量逐渐升高，而线粒体应激蛋白ClpP在缺血1.5 h时表达量升至最高，缺血3 h有所下降。见图2。

3讨论

脑缺血半暗带理论的提出，改变了缺血脑组织无法挽救的旧观点。半暗带决定着梗塞灶的大小，决定患者的康复质量，其特殊的临床意义使它成为脑缺血和脑保护作用的研究热点之一。因此，缺血性脑血管病治疗的关键在于及时挽救缺血半暗带尚未死亡的神经元。

*P<0.05 与假手术组相比 L：代表脑缺血损伤侧；R：代表未损伤侧

图2大脑皮质凋亡蛋白与线粒体应激蛋白的表达

线粒体应激主要反应在线粒体内非折叠蛋白增加。线粒体未折叠蛋白应答反应(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)是指由线粒体-细胞核信号转导通路所诱导的线粒体保护性基因包括线粒体分子伴侣和蛋白酶重建线粒体蛋白折叠环境中蛋白的稳态。目前认为线粒体应激过程包括三个层面，伴侣蛋白的改变及对氧化应激、线粒体损害的防御作用；线粒体蛋白酶的降解和损伤；线粒体功能障碍。因此，从线粒体应激角度出发探讨其与半暗带的关系，及时调控线粒体应激有望成为减轻脑损伤反应的重要途径。

再灌注后神经细胞的命运主要取决于缺血时间的长短，目前大多数人认为脑缺血后再灌注治疗时间窗在2-4小时之间[8]。因此，本实验我们采用了1小时、1.5小时和3小时3个不同缺血时间点复制脑缺血再灌注模型。

本实验HE结果证明，随着缺血时间延长，大鼠脑皮质神经元逐渐失去其正常形态，脑损伤逐渐加重。进一步的Western Blot结果显示，活化的凋亡蛋白cleaved-caspase3随着缺血时间的延长，表达量逐渐升高，在缺血3 h时表达最强，说明凋亡参与了半暗带的形成。但是线粒体应激相关蛋白ClpP则出现先增高后降低，在缺血1.5 h时表达最强，早于3 h时表达最强的cleaved-caspase3。UPRmt是维持线粒体自身稳态的重要因素，它通过ClpP产生蛋白片段作为危险信号，激活PKR(Protein kinase RNA-activated)，进而磷酸化elF2α，阻止蛋白翻译，并促进核编码的线粒体分子伴侣HSP60等的产生[9]。ClpP表达升高说明在大鼠脑缺血再灌发生脑损伤时，线粒体应激反应也早于细胞凋亡，对脑缺血再灌注损伤诱导凋亡可起到防御作用。

综上所述，脑缺血再灌注损伤过程中线粒体应激反应早于细胞凋亡，因此及时调控线粒体应激有望成为减轻脑损伤反应的重要途径。

参考文献：

[1]Ebinger M,De Silva DA,Christensen S,et al.Imaging the penumbra-strategies to detect tissue at risk after ischemic stroke[J].Clin Neurosci,2009,16(2):178.

[2]Liu M,Eguchi N,Yamasaki Y,et al.Protective role of hematopoietic prostaglandin D synthase in transient focal cerebral ischemia in mice[J].Neuroscience,2009,163(1):296.

[3]Price CD,Yang Z,Karlnoski R,et al.Effect of continuous infusion of asialoerythropoietin on short-term changes in infarct volume,penumbra apoptosis and behaviour following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(2):185.

[4]Pellegrino MW,Nargund AM,Haynes CM.Signaling the mitochondrial unfolded protein response[J].Biochim Biophys Acta,2013,1833(2):410.

[5]Jovaisaite V,Mouchiroud L,Auwerx J.The mitochondrial unfolded protein response,a conserved stress response pathway with implications in health and disease[J].J Exp Biol，2014,217(Pt 1):137.

[6]Wang W,Kang J,Li H,et al.Regulation of endoplasmic reticulum stress in rat cortex by p62/ZIP through the Keap1-Nrf2-ARE signalling pathway after transient focal cerebral ischaemia[J].Brain Inj，2013,27(7-8):924.

[7]Lu Y,Kang J,Bai Y,et al.Hyperbaric oxygen enlarges the area of brain damage in MCAO rats by blocking autophagy via ERK1/2 activation[J].European Journal of Pharmacology,2014,728C:93.

[8]Jin X,Liu J,Yang Y,et al.Spatiotemporal evolution of blood brain barrier damage and tissue infarction within the first 3h after ischemia onset [J].Neurobiology of Disease,2012，48(3):309

[9]Rath E,Berger E,Messlik A,et al.Induction of dsRNA-activated protein kinase links mitochondrial unfolded protein response to the pathogenesis of intestinal inflammation[J].Gut，2012,61(9):1269.

基金项目:吉林大学白求恩前沿交叉学科创新项目(No.2013101003)；吉林大学“大学生创新性实验计划”项目(No.2014A79352); 吉林省卫生厅项目(No.20132068);吉林省科技厅项目(No.20150414026GH)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0890-03

(收稿日期：2015-12-18)