葡萄上赭曲霉毒素A产生机制及生物检测方法研究进展

彭娅萍，杨其亚，张晓云，张红印

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江,212013)



葡萄上赭曲霉毒素A产生机制及生物检测方法研究进展

彭娅萍，杨其亚，张晓云，张红印*

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江,212013)

摘要赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)主要由赭曲霉、黑曲霉及青霉菌的某些菌株产生，具有多种毒性，葡萄及其制品中OTA污染在全球范围内普遍存在，严重影响人类和动植物的健康。控制OTA的方法已经有许多研究，其中生物方法安全环保是目前研究的热点，而认识OTA来源及产生机制是生物防治污染的基础，随着分子生物学的发展，一些新型的分子快速检测方法已经被研究出来。对OTA的毒理特性、污染及来源、产毒机制、分子生物学快速检测手段等方面进行了综述，为寻求有效的控制产毒和降解毒素方法提供理论参考，以期降低OTA污染。

关键词赭曲霉毒素A (Ochratoxin,OTA)；污染来源；产毒机制；生物检测手段

赭曲霉毒素是许多丝状真菌包括曲霉属和青霉属菌种合成的次生代谢产物，它包括19种结构类似的化合物，结构通式： R2=Cl或H；R3= H或OH； R4= H或OH；R5= H或OH；R1可以为苯丙氨酸，乙酯，甲酯，羟基以及各种其他氨基酸(图1)，赭曲霉毒素A(OTA) 毒性最大，其R1=苯丙氨酸，R2= Cl，R3=H，R4=H，R5=H，分子式为C20H18Cl NO6，摩尔分子量为403.82 g/mol。其中衍生物OTα(R1=OH，R2=C1) 和OTβ(R1=OH，R2=H)是赭曲霉毒素A的中间代谢产物。OTA 的苯丙氨酸基团被其他氨基酸取代的衍生物毒性要低于OTA[1]。赭曲霉毒素A性质稳定，耐酸，耐高温，不易降解，食品一旦污染OTA，要完全去除是非常困难的。研究证实OTA广泛存在谷物，葡萄及制品和咖啡豆及其制品中，对人类和动物都有一定的潜在危害[2]。

图1　赭曲霉毒素主体结构[3]Fig.1　General structure of ochratoxin A metabolites

1OTA毒理特性

OTA为稳定的无色结晶化合物，呈弱酸性， OTA 结构中的羟基基团以电离形式存在是 OTA 发挥毒性所必需的条件，氯原子则在其遗传毒性上发挥十分重要的作用。目前关于OTA的毒理学和病理学研究侧重于动物实验的结果。该分子在几个种动物中可以具有几个方面的影响，如肾毒性，肝毒性，肠道毒性，神经毒性，致畸和免疫毒性，并可能在小鼠和大鼠上导致肾脏和肝脏肿瘤[4-6]，但其毒性取决于受试动物性别，品种和细胞类型[7]。由于在各种微生物和哺乳动物试验得到的结果存在矛盾，OTA的遗传毒性状况仍存在争议。但是，在大鼠上的慢性实验和猪的亚急性实验研究中证明长期摄入OTA， DNA会形成加合物, 且低浓度的OTA会通过氧化染色质和损伤DNA抑制体外培养的干细胞生长[8-9]。在充足的动物试验结果基础上推断OTA是一种人类致癌物。然而并没有充分的实验证明OTA摄入和人类癌症发生有直接的关系，但是已经证实保加利亚及南斯拉夫巴尔干地区尿路移行细胞肿瘤导致的死亡率与地方性肾病的地理分布相关，而OTA具有极大的肾毒性[10]。

2葡萄及其制品上OTA产生来源

葡萄及其制品是重要的OTA污染来源，鉴于OTA对人体可能造成的危害，国内外一些组织和科研机构对葡萄及其制品中的OTA的含量做了限量标准[11]。2005年欧盟规定葡萄和葡萄制品中OTA的限量为2.0 μg/kg[12]。我国在2008年提出增设葡萄酒中赭曲霉毒素A限量标准为2.0 μg/kg[13]。统计结果表明，欧洲葡萄酒OTA污染在0.01～3.4 μg/L之间，污染程度与葡萄收获年份和地理位置相关，且由北到南梯度增加[14]。研究发现，葡萄汁中也存在着OTA的污染，LARCHER和NICOLINI发现，所有的葡萄汁浓缩样品中均存在OTA。葡萄干制品中OTA的含量高于葡萄酒和葡萄汁，欧洲的南部地区葡萄干制品中的OTA的污染量为2.3 μg/kg[15]。通常OTA污染发生在葡萄采摘和加工前，甚至从葡萄园种植开始就受到各种产毒菌尤其是黑曲霉属(炭黑曲霉和黑曲霉)的污染，在果实成熟阶段OTA积累量迅速增加[16-17]。

2.1主要产毒菌

目前，已报道的OTA产生菌主要包括：青霉和曲霉这两个属，还有少数石座菌属和枝孢属菌株(表1)。除表1所列出的主要产毒菌外，还有许多种其他产毒菌，比如曲霉属新发现的高产产菌毒A.westerdijkiae，一些产毒量较低，例如蜂蜜曲霉(A.melleu)、洋葱曲霉(A.alliaceus)、硫色曲霉(A.sulphureus)、佩特曲霉(A.petrakii)及寄生曲霉(A.parasiticus)。青霉属中其他产毒菌有变幻青霉(P.variabile)、圆弧青霉(P.cyclopium)、产黄青霉(P.chrysogenum)、纯绿青霉(P.polonicum)等。

表1　主要赭曲霉毒素A产毒菌[3, 18-21]

2.2产毒条件

在产毒的种内并非所有菌株都能产毒，产毒株的比例和产毒量与产毒基质，条件及试验方法密切相关。

2.2.1培养基组分

碳源、氮源以及Zn2+、Mg2+和培养时间[22]等条件对不同产毒菌株产OTA影响很大。CARINA分析了时间、温度以及培养基对黑曲霉产毒的影响，发现25 ℃下黑曲霉菌株时间上一般在第14天产毒量较高，研究同时表明, 不同的培养基对其有影响, 在酵母膏察氏培养基上培养产毒较多[23]。GEREZ研究表明，黑曲霉在高水分活度(aw=0.995)时在查氏酵母膏培养基(CYA)上利于菌株生长与产毒[24]。

2.2.2培养条件

除了培养基质的影响外，一些其他的霉菌生长条件也能影响毒素的产生，温度、湿度和pH值等培养条件通过不同的方式影响OTA产生。青霉一般适宜生长在温度低于30 ℃，水分活度低于0.8的环境下；赭曲霉适宜在温和的温度，且水分活度高于0.8的环境中生长；而炭黑曲霉、黑曲霉，适宜在30 ℃左右的温度下生长，且容易感染成熟果实[25]。当温度低于15 ℃时，真菌的生长被明显抑制，OTA的产生也得到有效的控制[26]。QUINTELA等发现，少雨且高温地区的葡萄更容易污染OTA[27]。O‘CALLAGHAN等研究发现赭曲霉在低pH时(pH3.0～4.0)产毒量高，碱性环境下产毒减少[28]。然而pH对日耳曼青霉产毒的影响恰恰相反，与产毒相关的基因otapksPN在酸性(pH<5.0)条件下表达量低，pH 6～8之间表达量最高，而该基因在不同pH 环境下与OTA产毒量呈正相关[29]。

3OTA生物合成途径与基因调控

3.1合成途径

关于OTA性质的研究很多，但OTA产生菌的一些生物合成途径并不明确。HUFF和HAMILTON[30]根据OTA的分子结构提出的生物合成途径的假设模型，OTA生物合成的步骤分为3个部分：

第一部分是聚酮化合物在聚酮合酶参与下生成蜂蜜曲霉素，然后酰基活化，蜂蜜曲霉素被甲基氧化为7-羧基蜂蜜曲霉素(OTβ)，再由过氧化物酶参与氯化反应生成赭曲霉毒素α(OTα)，该化合物随后被三磷酸腺苷活化。

第二部分的苯丙氨酸通过莽草酸合成途径，接着发生酯化反应，以便它能够参与随后酰基转移反应。

第三部分是前两部分活化的前体由多肽合成酶生成OTC，OTC是一种OTA的乙酯衍生物。最后一个步骤是由酯酶参与的酯化或酯交换反应，最后产生OTA。其中异香豆素组是由乙酸通过聚酮合成途径形成的戊酮，聚酮化合物合酶(PKS)是关键酶，它以类似合成霉菌毒素如伏马菌素和黄曲霉毒素的方式参与OTA生物合成[31-32]。

HARRIS和 MANTLE对该合成途径提出一些异议[33]，他们添加带标记前提到赭曲霉培养基中，结果发现中间产物OTα大量参与合成过程，OTβ部分参与，而蜂蜜曲菌素没有被检测到参与合成途径。

3.2产毒基因调控

在分子水平上，基因组DNA库和cDNA文库构建技术；PCR；基因敲除；传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)；基因芯片；PCR和反向PCR等技术已被用于研究PKS基因调控重要各种聚酮化合物的生物合成[34-35]。目前关于分子机制的研究主要以关键酶聚酮化合物合酶(PKS)为研究对象，KS域是不同的PKS中的保守区域，针对KS域设计简并引物对，可以用于扩增KS结构域的片段。这些简并引物对已经成功地应用于OTA产生菌的研究。VARGA和EDWARDS等已经确定赭曲霉中5种不同的PKS基因[36]。另外在A.westerdijkiaeNRRL 3174中9种KS域以及5种炭黑曲霉(2Mu134 = CBS 120167)中的KS域[37]已被发现。

O’CALLAGHAN等克隆了赭曲霉中的聚酮合酶(PKS)基因(基因库登录号：AY272043)试图阐明OTA的分子生物合成途径[38]，但未发现该基因与检测中间代谢产物如蜂蜜曲菌素产生是否有关系。随后，KAROLEWIEZ和GEISEN发现日耳曼青霉中聚酮合成酶基因otapksPN(基因库登录号：AY196315)是OTA生物合成必不可少的[39]。BACGAB等[40]研究找出A.westerdijkiae生物合成OTA的PKS基因aoks1(基因库登录号：AY583209)，中断aoks1表达，OTA就无法合成，但不影响其他代谢产物特别是蜂蜜曲菌素的生物合成，在突变体中PKS基因已被敲除则不能合成的OTA，但仍产生蜂蜜曲菌素，这一发现支持HARRIS和 MANTLE的结果。

4OTA污染控制

控制OTA污染主要从降解已存在的毒素和防止毒素产生两方面，葡萄采前的严格规范的管理是最有效的控制OTA污染的方法，但是如果污染已经发生，必须采取一些适当的方法将其去除。

4.1降解已存在的毒素

橡木塞是葡萄酒酿造过程中必备的物质，SAVINO等发现其能去除红葡萄酒中的OTA，甚至使用没有污染OTA的葡萄渣，尤其是与葡萄酒种类相同的葡萄渣，能够很好的清除OTA并保持葡萄酒的色泽以及营养价值。葡萄酒酿造过程OTA也存在降解，根据品种不同降解率为46.83%～86.5%，但是这一过程主要是吸附作用残存在固体果渣和生物体中，对环境、人类仍然存在潜在的危害。辐照是另一种简单、易操作的方法，60Coγ射线辐照水溶液的OTA，在4 kGy的辐照剂量下，OTA降解率达到90%，但对于能否降解葡萄及其制品中的OTA还需进一步的研究。

微生物降解生物降解OTA是一种相对安全、环保的方法，成为替代化学品的最佳选择，目前被认为是最具有前景的方法。国内外大量文献报道了微生物(主要有细菌，酵母，霉菌)在水溶液中去除OTA的能力。但是在酵母残渣里面的含有较高量的OTA，且热杀死的分生孢子仍然具有去除OTA的作用。推断可能是酵母细胞壁的生甘露糖蛋白对OTA的吸附作用。

4.2预防毒素产生

由于赭曲霉毒素性质稳定不易分解，一旦产生很难处理，防止毒素产生是从源头上控制赭曲霉毒素的污染问题，是未来OTA防治领域的研究重点。早期和快速检测并抑制潜在OTA产生菌生长对减少OTA污染十分重要。

首先在于良好的耕作和储存方法，包括降低农作物在收割、贮存、运送和处理期间受霉菌感染和减少霉菌生长，是预防农作物不受赭曲霉毒素A污染的基本防线。减少谷物的水分确保谷物在贮存和运送期间保持干燥，使其水分含量保持0.70 以下。

化学杀菌剂因其具有的高效性，已经普遍应用于实践中，如多菌灵(Carbendazi)和咯菌腈(Fludioxonil)已用于抑制葡萄园中多种霉菌的生长。然而，MEDINA等发现，多菌灵虽然能抑制多种霉菌，但是对炭黑曲霉的抑制作用很小，而且会增强炭黑曲霉产生OTA，这再次引起了人们对化学杀菌剂的质疑，且化学杀菌剂在应用上的安全性也是人们所担忧的。

最佳方法就是利用生物方法进行预防，通过利用有益微生物控制产生赭曲霉毒素霉菌的生长减少霉菌毒素的合成是一种有效可行的方法，有研究表明普鲁兰类酵母不仅能够控制有效的抑制炭黑曲霉在葡萄上的生长，同时能够降解OTA。

在控制OTA污染的研究中，我们需要寻求快速有效的监测体系，以及抑制产毒和降解毒素的方法。通过认识OTA合成机制，结合现代分子生物学技术，在污染初期快速检测产毒菌并阻断霉菌毒素产生，研究出快速有效具有广谱性的控制毒素方法，并投入到商业化应用。

5分子生物学应用于OTA污染防控

在目前的OTA检测中，多集中在致病霉菌的代谢产物中是否含有赭曲霉毒素。早期和快速检测潜在OTA产生菌对减少OTA污染十分重要，快速的方法来检测产毒真菌可以帮助防止霉菌毒素进入食物链。通常的真菌定性和定量分析方法步骤比较复杂。常利用的OTA检测方法有薄层层析法，荧光高效液相法，液相质谱联用法，近红外光谱技术(near-infrared reflectance spectroscopy,NIRS)，时间分辨荧光免疫分析(time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)技术，基于免疫学原理的酶联免疫法和胶体金免疫层析技术。这些方法大都需要复杂的操作过程，有些成本昂贵。PCR技术可以直接通过扩增特异性基因组标记物来检测替代了费时费力的微生物方法，这一方法最重要的是引物设计的可靠性和得到目标菌类的DNA序列。

5.1通过PCR检测产赭曲霉毒素菌种

近年来PCR技术已被开发用于检测和区分真菌毒素产生菌的主要种类。rRNA，β微管蛋白，延伸因子1α和钙调蛋白等相关基因中包含高度保守以及可变序列区域。目前针对曲霉和青霉属中OTA产生菌的新型诊断方法的引物对已经设计出。PELEGRINELLI和FUNGARO等[41]设计的引物对对葡萄的主要OTA产生菌炭黑曲霉具有高特异性，不过该引物无法区分炭黑曲霉是否产毒。

菌种特异性检测的首要目标是确定特定的霉菌是否产生毒素。许多真菌毒素的生物合成的基因存在于基因簇中，并且一些产毒基因在几个菌种中都存在。不同菌种的同源性真菌毒素生物合成基因内的区域可用于设计引物，以检测相关产毒菌种[31]。这一方法已成功应用于黄曲霉毒素产生菌，单端孢霉烯产生菌，伏马菌素产生菌[42]等的检测。PCR法用于分化检测赭曲霉菌和青霉菌属中的日耳曼青霉和疣状青霉的方法已经研制成功。OTA的生物合成途径中的两个基因，即OTA聚酮化合物合酶基因(otapksPN)和日耳曼青霉多肽合成酶基因(otanpsPN)[27, 29]。疣状青霉始终只与引物对otanpsPN基因有阳性反应，而这两个基因则都对日耳曼青霉有效。该方法已用于从肉制品中分离62种产毒青霉属菌株。SUANTHIE等研究出多元的RT-PCR分析方法，可以用于检测多样广范围的产毒霉菌，他们设计出一种广谱的PCR引物，计算机模拟分析中该引物能扩增包括40种曲霉菌，23种镰刀菌，32青霉菌以及其他64种真菌[43]。

5.2RT-PCR对OTA定量检测的应用

实时PCR(RT-PCR)技术通过定量DNA来检测产毒菌。 RT-PCR对OTA产生菌的检测和定量已经成功在许多食品中得到运用。在设计以基因组靶DNA作为模板的PCR方法时，需要考虑到大多数霉菌毒素生物合成是一个非常复杂的过程，还有转录水平复杂的调节作用以及环境因素重要影响，找到基因表达量和毒素浓度之间的相关性是很重要的。通常选择OTA生物合成相关基因进行定量检测。通过使用RT-PCR技术，以产毒相关基因或者以管家基因为靶向设计的引物为研究对象。已经证实炭黑曲霉中OTA浓度和DNA 表达量之间呈正相关关系[44]。黑曲霉中的PKS基因(An15g07920)表达量与OTA合成相关，研究表明该基因参与OTA生物合成，在产毒培养基上PKS基因被上调，而且在检测到OTA浓度增长的12 h前PKS基因大量表达[45]。目前， RT-PCR定量方法被认为是替代常规检测葡萄上炭黑曲霉量和OTA含量之间的关系的最好的方法。ATOUI等[46]根据其相关性提出，葡萄果实中炭黑曲霉 DNA含量必须低于10 ngDNA/g才符合欧盟OTA限量标准。它可通过定量测定真菌相关基因生物量来进行食品快速质量评估，从而使监测OTA产生成为可能。

6展望

葡萄及其制品中赭曲霉毒素A污染在全球范围分布十分广泛，且具有多种毒性，严重危害人类和动植物健康。从源头上控制赭曲霉毒素A的污染问题是未来OTA防治领域的研究重点，分子生物学方法应用于OTA的监测和预防十分快速简便，它基于真菌基因组研究的发展。目前对于OTA的合成机制已经有一定的进展，各种菌产生OTA的途径并不完全相同，需要通过对大量OTA产生菌基因组学的比较研究，来挖掘出新的OTA合成调控关键基因，彻底阐明OTA的合成机制。这将有利于研究者寻找快速检测食品上产毒菌的方法和抑制毒素产生的方法，也即通过研究OTA合成途径和产毒基因，在污染早期人为干预阻断OTA合成。后基因组学的研究，对于深入分析农作物种植、生长、运输、储藏过程中产毒真菌群的滋生，真菌毒素的合成路径及其调控机制、产毒菌与农产品互作、危害食品品质的机理提供新的思路。

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Research progress ochratoxin A-producing mechanism in grapes and biological detection methods

PENG Ya-ping, YANG Qi-ya, ZHANG Xiao-yun, ZHANG Hong-yin*

(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

ABSTRACTOchratoxin A (OTA) is one of the five major kinds of mycotoxin commonly found in fruits and vegetables. Currently, OTA is mainly produced by Aspergillus and Penicillium. Studies showed that this molecule can have several toxic effects. Worldwide, OTA contamination in grapes and its derived products is a big threat to health of the human, plant and animal. There are many studies about OTA-controlling, and biological method is the hot spot currently as it is safe and environmental-friendly. A good knowledge of OTA sources and production mechanism is the foundation for biological control of pollution. With the development of molecular biology, some new types of rapid molecular detection method have been developed. This review highlighted toxicological characteristics, the pollution and sources, toxin-producing mechanisms and PCR detection methods, which provided a theoretical basis for searching effective ways to control OTA production and degradation.

Key wordsochratoxin A；pollution sources； produce mechanism；biological detection methods

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606041

基金项目：国家自然科学基金(31271967)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20123227110015)；镇江市科技支撑计划-农业支撑项目(NY2013004)；江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(15)1048)

收稿日期：2015-12-08，改回日期：2016-02-25

第一作者：硕士研究生(张红印教授为通讯作者,E-mail：zhanghongyin126@126.com)。