响应面法优化微波辅助提取长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素

向江波，邓建朝，杨贤庆*，李来好，戚勃，胡晓，荣辉，杨少玲

1(中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州，510300)2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)



响应面法优化微波辅助提取长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素

向江波1，2，邓建朝1，杨贤庆1*，李来好1，戚勃1，胡晓1，荣辉1，杨少玲1

1(中国水产科学研究院 南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州，510300)2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)

摘要文中采用响应面微波提取法对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取工艺进行研究。单因素和Box-Behnken设计实验结果表明：微波功率、乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率有显著影响。优化的提取工艺为微波功率200 W，乙醇体积分数为85%，料液比为1∶30 (g∶mL)，萃取时间为20 min，萃取温度为45℃，在此条件下长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率为91.9%，模型的R2=98.4%。与未经微波处理的传统方法超声法、回流法和水浴法相比，微波处理最高可使长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素提取率提高79.8%，超声法、回流法和水浴法蕨藻红素的提取率分别为微波提取的71.8%、85.69%和55.77%，且提取时间长，消耗溶剂大。

关键词长茎葡萄蕨藻；蕨藻红素；微波辅助提取；响应面提取法

广阔的海洋占地球面积的 70% 以上，蕴藏着丰富的生物资源。海藻是海洋生物资源的重要组成部分[1-2]。近年来众多报道表明很多海藻成分复杂，除富含维生素、矿物质、氨基酸及糖类外，还含有多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸和多萜类等活性物质。多年研究表明海藻具有护肤美容，抗菌消炎，抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，减肥消脂和增强免疫力等一系列功能[3-5]。长茎葡萄蕨藻藻是海藻的一种，长茎葡萄蕨藻中含有能被人体良好利用的活性物质蕨藻红素[6]。蕨藻红素，一种双吲哚生物碱，是一种重要的抗氧化和抗炎症的生物活性成分。据相关文献[7]报道，蕨藻红素具有良好的延缓花朵衰老，延缓果实成熟，除草剂，脱草剂，竞争性抑制生长激素等功效。因此，蕨藻红素的提取能够很大程度的提升长茎葡萄蕨藻的价值。

近年以来，微波提取技术已经在天然活性产物领域被广泛采用，微波具有很强的穿透力，而且能和一些水分子、有机物质等极性分子相互作用，进而造成植物细胞壁内部压力增加，这个压力的增加导致植物细胞壁的破碎，促进植物内部物质的释放，提高单位质量的提取率。传统提取方法主要依靠热传递，与传统项目相比，微波提取具有低耗能、耗时少等优势特点，与此同时，微波还具有高效率，易操作等优势。因此，微波提取被广泛应用于生化提取工艺中[8-10]。响应面分析法(RSM)作为优化实验条件和工艺参数的有效方法，缩短了试验时间，它的回归方程具有更高的精密度，并且能够探究多个变量之间的关系，已经在化学工程，生物工程，食品工程等领域广泛广泛采纳[11-12]。目前，蕨藻红素的提取工艺参数主要是通过正交试验获取[13]。但是正交试验不能精确探究出多因素之间的相互关系，文中以南海长茎葡萄蕨藻为研究对象，在单因素实验的基础上，应用响应面分析法(RSM)对长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的微波提取工艺进行优化，以得到最佳的蕨藻红素提取工艺。

1材料与方法

1.1材料与试剂

长茎葡萄蕨藻藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)、蕨藻科 (Caulerpaceae)、蕨藻属 (Caulerpa)，拉丁名为C.lentillifera。采于南海，晾晒后装入封口袋密封，带回实验室作为后续实验的样品。色谱纯甲醇，美国Sigma-Aldrich；乙醇 广州化学试剂厂(分析纯)；实验用水均符合GB/T6682 一级水的标准。

1.2仪器

常压微波辅助合成萃取仪(MAS-Ⅱ)，上海新仪器微波化学科技有限公司；真空泵(AP-9925)，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；超纯水机(MILLIQ)，美国Millipore有限公司；旋转蒸发仪(RE-2000A)，上海亚荣生化仪器厂；(HH-4)数显恒温水浴锅，常州奥华仪器有限公司；(SB25-12DTD)超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；分析天平，瑞士 Mettler-Toledo 公司；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；Agilent1100 高效液相色谱仪(配有DAD检测器)美国 Agilent 公司。

1.3实验方法

1.3.1提取工艺

将采集的长茎葡萄蕨藻用清水超声清洗干净,除去泥沙等杂质，45 ℃烘干,粉碎后过60目筛子,称取一定量的海藻,用一定体积的乙醇在一定的微波条件下提取,过滤,乙醇定容,高效液相色谱测试。

1.3.2测定方法

1.3.2.1蕨藻红素的液相条件

色谱条件：色谱柱为Athena C18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流动相甲醇-0.2%冰乙酸(体积比80∶20)；检测器 88232UV 紫外检测器；检测波长315 nm；流速0.8 mL/min；柱温 30℃；进样量20 μL[14]。

1.3.2.2蕨藻红素的提取率计算方法

采集的长茎葡萄蕨藻经过清洗、干燥、粉碎后，准确称取 3.0 g,在一定条件下微波提取，提取溶液定容至100 mL,由高效液相色谱仪测得蕨藻红素的峰面积A。根据响应面实验设计得出的蕨藻红素的提取的最优工艺组合，在最优的工艺组合下，等量的长茎葡萄蕨藻经过微波提取后，测定目标峰峰面积；将滤渣进行二次提取，测定目标峰峰面积；如此重复操作，直至提取物中目标峰面积接近为零，表明长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素已提取完全。将多次提取的目标峰峰面积相加Amax即为3.0 g长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素总量，各单工艺条件下提取一次的蕨藻红素的目标峰峰面积为A，得出各提取条件下蕨藻红素的提取率(提取率=A/Amax)[13]。

1.3.3单因素实验

参考有关文献中蕨藻红素的提取条件，选定微波功率、乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度进行单因素实验，分别对单个因素选5个水平，来考察单因素对长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取率的影响。

1.3.3.1微波功率对蕨藻红素提取率的影响

准确称取清洁干燥过的样品3.0 g，按照料液为1∶30 (g∶mL)、 90%的乙醇在萃取时间15 min、萃取温度为45℃、分别在微波功率100、200、300、400和500 W下进行萃取，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取率，以3次实验平均值来表示提取率，试验结果如图1所示。随着微波功率的升高蕨藻红素的提取率依次升高，在升高至200 W之后，蕨藻红素的提取率是随着微波功率的升高反而下降，因此选取200 W为最优微波功率。

图1　微波功率对蕨藻红素提取率的影响Fig.1　The effect of power on the caulerpin extraction rate

1.3.3.2乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响

准确称取清洁干燥过的样品3.0 g，按照料液比为1∶30 (g∶mL)、萃取时间15 min、萃取温度45 ℃、微波功率200 W，分别在乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%和100%进行萃取，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取率，以3次实验平均值来表示提取率，实验结果如图2所示。随着乙醇浓度的升高蕨藻红素的提取率依次升高，在升至90%之后，蕨藻红素的提取率是随着乙醇浓度的升高反而下降，因此选取乙醇浓度90%为最佳萃取浓度。

图2　乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响Fig.2　The effect of ethanol concentration on the caulerpin extraction rate

1.3.3.3料液比对蕨藻红素提取率的影响

准确称取清洁干燥过的样品3.0 g,按照萃取时间15 min、萃取温度为45℃、微波功率200 W、乙醇浓度90%，分别在料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60 (g∶mL)进行萃取，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取率，以3次实验平均值来表示提取率，实验结果如图3所示。随着料液比的升高蕨藻红素的提取率依次升高，在升高至1∶40 (g∶mL)之后，1∶50 (g∶mL)和1∶60 (g∶mL)对提取率的影响变化不显著(P>0.05)[15]。考虑到提取成本及后续纯化难度，最优料液比以1∶30 (g∶mL)为宜。

图3　料液比对蕨藻红素提取率的影响Fig.3　The effect of solid-to-liquid ratio on the caulerpin extraction rate

1.3.3.4萃取时间对蕨藻红素提取的影响

准确称取清洁干燥过的样品 3.0 g，按照料液比 1∶30 (g∶mL)、萃取温度为45 ℃、微波功率 200 W、乙醇体积分数90%，萃取时间选取 5、10、15、20和25 min 5个点，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取率，以3次实验平均值来表示提取率，实验结果如图4所示。由图4可见，随着萃取时间的增加蕨藻红素的提取率依次升高，当萃取时间达到20 min时提取率达到最大值，之后随着萃取时间的增加，蕨藻红素的提取率降低，因此选取20 min为最佳萃取时间。

图4　萃取时间对蕨藻红素提取率的影响Fig.4　The effect of extraction time on the caulerpin extraction rate

1.3.3.5萃取温度对蕨藻红素提取率的影响

准确称取清洁干燥过的样品3.0 g，按照料液比 1∶30 (g∶mL)、萃取时间 20 min、微波功率 200 W、乙醇体积分数90%，萃取温度 选取30、40、50、60和70 ℃5个点，提取液经抽滤后，定容至100 mL，由高效液相色谱法测定蕨藻红素的峰面积，计算出提取率，以3次实验平均值来表示提取率，实验结果如图5所示。随着温度的升高蕨藻红素的提取率依次升高，当温度达到40 ℃时提取率达到最大值，因此选取40 ℃为最佳萃取温度。

图5　萃取温度对蕨藻红素提取率的影响Fig.5　The effect of temperature on the caulerpin extraction rate

2结果与讨论

2.1因素的选择及方案

综合1.4的单因素试验结果，固定料液比 1∶30 (g∶mL)，微波功率 200 W， 根据 Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[16]，选取对长茎葡萄蕨藻蕨藻红素提取影响较显著的萃取温度T、乙醇浓度C、萃取时间t这3个因素(分别以A、B和C)，采用3因素3水平的响应面分析方法确定最佳提取工艺条件，试验因素和水平设计见表1。

表1　响应面分析因素与水平表

2.2响应面实验结果

在单因素实验的基础上，以微波温度T=X1、乙醇浓度C=X2、微波时间t=X3为自变量，以长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的提取率Y为响应值，进行响应面分析实验。实验结果见表2。

表2　响应面分析实验及实验结果

表2响应面分析实验及实验结果中，实验1～12为析因实验，13～17为中心实验，其中区域的中心点为实验零点，析因点为自变量X1、X2、X3所构成的三维顶点，其中零点实验重复5次，用以估计实验误差，对数据进行ANOVA分析，分析结果见表3，3个因子X1、X2、X3经过拟合得到的回归方程为：Y=84.54+0.25×X1-1.05X2+0.68×X3-9.2×X1×X2+1.08×X1×X3-1.76X2×X3-2.91×X12-0.45×X22-9.01×X32,由表3的分析结果可知，整体模式极为显著(“Pr >F” 值 <0.001)；失拟项不显著(“Pr >F” 值 =0.629 4>0.05)，说明拟合回归方程对试验的拟合性良好。模型的R2=98.44%，说明实验方法是可靠的。

图6～图8准确的给出了各个影响因子相互作用的等值线分析图和响应面的3D图，从响应面的等值线和响应面的最高点可以看出，在所选的范围内是存在极值的，既是等高线最小椭圆的中心点，也是响应面的最高点。图6表明，单个X1和X2都对响应值有很大的影响，但是作用在一块时时对提取率的影响没那么大，并且X2对响应值Y的影响是高于X1的。X1和X2在编码值0以上都得到了很好的响应值，这与ANOVA分析的实验结果是基本一致的，图7表明，X1和X3的相互作用比较强，编码值较大的X1和X3反而却导致响应值Y值减少，这也与ANOVA的分析结果是吻合的。图8表明，X3在编码值为0跟编码值在0上下浮动对响应值Y的影响是微小的，X1在编码值以上时，响应值Y是增加的，X1与X3的相互作用也较强，经过Design-expert分析出最大响应值(Y)时对应的编码值是X1=1.00，X2=-1.00，X3=0.195。与之对应的长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的最佳提取条件是X1=45 ℃，X2=85%，X3=20.195,理论提取的最佳值为92.01%。

表3　响应面ANOVA的分析结果

图6　Y=f(X1,X2)的响应面和等高线分析图Fig.6　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

图7　Y=f(X1,X3)的响应面和等高线分析图Fig.7　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

图8　Y=f(X2,X3)的响应面和等高线分析图Fig.8　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

为了验证响应面提取蕨藻红素的可行性，采用响应面得到的最优值的提取条件去进行长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的验证试验，同时考虑到实际的操作性和生产的便利，以料液比1∶30 (g∶mL),微波功率 200 W,萃取温度 45℃，乙醇浓度85%,萃取时间 20 min。3次平均实验得到实际的平均提取率为91.9%，3次试验相对标准偏差(RSD)分别为0.479%，0.486%，0.457%，重现性好。与理论值相差0.11%。因此得出结论，用微波辅助提取响应面优化长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素是可行的，得到的蕨藻红素的提取是具有实际应用价值的。

2.3其他提取方法

准确称取清洁干燥过的样品 3.0 g，加入相应体积 85% 的乙醇，按照表4的条件分别用超声、回流和水浴加热提取方法提取长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素，3次实验取平均值，实验结果如表4所示，超声法、回流法和水浴法蕨藻红素的提取率分别为微波提取的71.8%、85.69%和55.77%，且提取时间长，消耗溶剂大。

表4　其他提取蕨藻红素的方法

3结论

本实验在单因素实验的基础上，将响应面法应用于微波提取长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的提取实验中，实验结果表明，微波萃取温度、萃取时间和乙醇浓度的平方项对长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素提取影响显著，说明萃取温度、萃取时间和乙醇浓度对长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的提取不是简单的线性关系。回归方程和回归方程的分析以及验证试验的结果表明，此方法合理可行，得到长茎葡萄蕨藻中蕨藻红素的最佳提取条件为：料液比 1∶30 (g∶mL),微波功率 200 W,萃取温度 45 ℃，乙醇浓度85%,萃取时间 20 min，长茎葡萄蕨藻中的蕨藻红素的实际提取率为91.9%。

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Optimization of microwave-assisted extraction of cauperpin fromCaulerpalentilliferaby response surface method

XIANG Jiang-bo1，2, DENG Jian-chao1, YANG Xian-qing1*，LI Lai-hao1,QI Bo1, HU Xiao1, RONG Hui1, YANG Shao-ling1

1(National center for aquatic products processing technology research and development, Key laboratory of the ministry of agriculture of aquatic products processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Guangzhou 510300,China)2(Food college, Shanghai ocean university, Shanghai 201306，China)

ABSTRACTThe extraction technology of caulerpin from the Caulerpa lentillifera was studied. The microwave extraction and response surface methodology (RSM) were applied. According to the single factor and Box-Behnken design, the microwave power, ethanol concentration, the ratio of solid to liquid, extraction time, extraction temperature shows significant effects; the optimized extraction technology parameters are: microwave power 200 W, 90% ethanol as extraction solvent, material-liquid ratio of 1∶30 (g∶mL), extraction time 20 minutes and the extraction temperature 45 ℃. Under the above conditions, the extraction rate of caulerpin from the caulerpa lentillifera is 85%. The model’s square of R2 is 98.4%, the experimental results indicate that the optimized extraction of caulerpin from the caulerpa lentillifera by microwave assistant extracting and response surface methodology (RSM) is feasible. It provides a theoretical basis for improving the extraction rate of caulerpin.

Key wordsCaulerpa lentillifera; caulerpin; microwave extraction; response surface methodology (RSM)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606037

基金项目：国家自然科学基金项目(21205138)；广东省海洋渔业科技与产业发展专项(A201401C02)；广东省科技计划项目(2013B021100013)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2014YD05，2010TS17) ；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2014YD05，2010TS17，2014TS24)

收稿日期：2015-09-24，改回日期：2015-12-22

第一作者：硕士研究生(杨贤庆研究员为通讯作者,E-mail: yxqgd@ 163. com)。