奇亚籽提取物体外抗氧化活性研究

相启森，时国庆，赵震宇 ，马云芳，崔席席，申瑞玲*

1(郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州，450002)2(食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州，450002)



奇亚籽提取物体外抗氧化活性研究

相启森1, 2，时国庆1, 2，赵震宇1, 2，马云芳1, 2，崔席席1, 2，申瑞玲1, 2*

1(郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州，450002)2(食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州，450002)

摘要奇亚籽是唇形科植物芡欧鼠尾草的种子，已被证实具有多种健康促进作用。文中评价了白奇亚籽和黑奇亚籽的体外抗氧化活性并测定了其总多酚和总黄酮含量。结果表明：2种奇亚籽提取物均能够以浓度依赖的方式清除DPPH·和ABTS+·，白奇亚籽提取物对DPPH·和ABTS+·的清除能力显著高于黑奇亚籽提取物；白色和黑色奇亚籽提取物的FeSO4·7H2O当量分别为(41.48+2.84) μmol/g和(29.70±2.43) μmol/g；同时，2种奇亚籽提取物均能显著抑制亚油酸自由基引起的β-胡萝卜素漂白。此外，2种奇亚籽提取物均能够有效抑制自由基诱导的亚油酸过氧化和牛血清白蛋白氧化降解。白奇亚籽和黑奇亚籽中总多酚含量分别为(3.40±0.09) mg CAE/g和(2.97±0.07) mg CAE/g，总黄酮含量分别为(1.24±0.06) RE mg/g和(1.07±0.08) RE mg/g。

关键词奇亚籽；抗氧化剂；自由基；铁离子还原能力

大量研究表明，机体氧化应激与神经退行性疾病、动脉粥样硬化、慢性炎症等疾病的发生及衰老过程密切相关[1]。研究证实，从膳食中补充VC、类胡萝卜素等抗氧化剂能够有效预防和降低氧化应激造成的健康危害[2]。近年来，从食物资源中分离和制备天然抗氧化剂愈发受到重视，并成为食品营养领域的研究热点[3-4]。

奇亚也被称为芡欧鼠尾草(SalviahispanicaL.)，是一种起源于墨西哥和危地马拉的作物，其种子即为奇亚籽。在南美洲，奇亚有着悠久的种植和食用历史。在哥伦布发现美洲之前，奇亚是墨西哥等地仅次于玉米和大豆的第三大粮食作物[5]。最近的研究表明，奇亚籽富含蛋白质、膳食纤维、多不饱和脂肪酸等营养物质和迷迭香酸等植物活性成分[5-7]。随着生活水平的提高和健康意识逐步的增强，消费者对营养和健康食品的需求也日益增强。因营养丰富、食用价值高并具有多种健康促进作用，奇亚籽在食品工业中有着巨大的开发利用前景。本研究以白色和黑色2种奇亚籽为研究对象，采用DPPH·清除试验等体外抗氧化体系评价了其提取物的自由基清除能力、铁离子还原能力及对脂质过氧化和蛋白质氧化降解的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

黑色和白色奇亚籽，购于澳大利亚Chia Co公司。

1.1.2主要仪器设备

UV 8100型紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器有限公司；DZKW型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；XQ200型多功能高速粉碎机，上海广沙工贸有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；微量移液器，德国Eppendorf公司；Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽、PowerPacTM通用电泳仪电源和ChemiDocTMXRS化学发光成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.1.3主要实验试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、β-胡萝卜素、菲洛嗪(Ferrozine)、牛血清白蛋白(BSA)、考马斯亮蓝R-250，合肥博美生物有限公司；2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、N, N′-亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)、异丙醇、Tris碱、溴酚蓝、过硫酸铵，美国Amresco公司；甲醇、冰乙酸、FeSO4·7H2O、VC(VitC)，天津市化学试剂六厂；三氯甲烷、Tween-40、Al (NO3)3、NaNO2、芦丁、没食子酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1奇亚籽提取物的制备

称取一定量奇亚籽并采用粉碎机进行干法粉碎，过60目筛，即为奇亚籽全粉。准确称取10.0 g奇亚籽全粉，加入200 mL体积分数80%的乙醇溶液，混匀后于室温提取2 h，于3 000 r/min、室温条件下离心10 min，取上清后重复提取1次。合并上清液，于45℃水浴下蒸发至干，用体积分数80%乙醇定容至25 mL，得浓度为400 mg/mL的奇亚籽提取物，于-18 ℃保存备用。

1.2.2DPPH·清除能力的测定

DPPH·清除试验参照Vulic等的报道并稍作修改[8]。取1.0 mL稀释后的奇亚籽提取液，加入4.0 mL DPPH甲醇溶液(100 μmol/L)，混匀后避光静置30 min，测定 517 nm处的吸光值(A1)。以相同体积80%乙醇代替奇亚籽提取液，测定其吸光值作为空白对照(A0)；按照公式(1)计算DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%= (1-A1/A0)× 100

(1)

以样品浓度为自量，自由基清除率为因变量作图并进行线性拟合，计算IC50值。另以Trolox标准梯度液(0～160 μmol/L)绘制标准曲线，奇亚籽的DPPH·清除能力表示为1 g奇亚籽样品中所含Trolox的当量微摩尔数(μmol Trolox/g)。

1.2.3ABTS+·清除能力的测定

参考文献[9]，将10.0 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和5.0 mL过硫酸钾溶液(7.35 mmol/L)混合，在室温下避光下反应16 h。用无水乙醇将ABTS自由基储备液进行稀释，使其在734 nm处的吸光度为 0.70 ± 0.02。取1.0 mL稀释后的奇亚籽提取液，加入4.0 mL ABTS自由基储备液，充分混匀，室温反应30 min，测定734 nm处吸光度并按公式(2)计算ABTS+·清除率。 [10]，将300 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、10 mmol/L的TPTZ溶液与20 mmol/L的FeCl3·6H2O按体积比10∶1∶1比例混合制备TPTZ工作液。取200 μL不同浓度的奇亚籽提取液，加入800 μL TPTZ工作液并混匀，37℃避光反应30 min，测定593 nm处吸光度。配制50～400 μmol/L的FeSO4·7H2O标准溶液，按照上述方法作处理并测定反应液在593 nm处的吸光值，绘制标准曲线。奇亚籽的铁还原能力(FRAP值)表示为1 g样品达到同样吸光度所需FeSO4的微摩尔数(μmol FeSO4/g)。

ABTS+·清除率/%=(1-A1/A0)× 100

(2)

其中A0为空白组的吸光度，A1为奇亚籽提取液处理组的吸光度。

1.2.4铁离子还原能力(FRAP)测定

1.2.5β-胡萝卜素/亚油酸漂白法

取1.0 mL β-胡萝卜素三氯甲烷溶液(5 mg/mL)，加入25 μL亚油酸及400 mg Tween-40，45 ℃旋转蒸发以除去三氯甲烷，然后缓慢加入100 mL 蒸馏水，并剧烈振荡，得β-胡萝卜素/亚油酸乳液。分别取1.0 mL不同浓度奇亚籽提取物溶液和4.0 mL β-胡萝卜素/亚油酸乳液加入到试管中并混匀，于470 nm处测定0 min吸光度；50 ℃水浴反应120 min后，测定470 nm处吸光度。按以下公式分别计算β-胡萝卜素漂白率和抗氧化活性[11-12]。

β-胡萝卜素漂白率(R)=ln (A0/A120)/t

(3)

式中：A0表示t=0 min时样品的吸光度，A120表示t=120 min时样品的吸光度。

抗氧化活性(AA)=[(R空-R样)/R空]×100

(4)

式中：R空表示空白组的β-胡萝卜素漂白率，R样表示样品的β-胡萝卜素漂白率。

1.2.6奇亚籽提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸脂质过氧化的影响

采用Fe2+/VitC反应体系产生的羟自由基诱导亚油酸发生脂质过氧化反应[13]。亚油酸用甲醇助溶，加入到1.5 mL离心管中，终浓度为1 mmol/L。在反应体系中，先加入不同浓度的奇亚籽提取物，混合均匀后再加入FeSO4和VitC(终浓度分别为50 μmol/L和1 mmol/L)。将离心管在37℃水浴避光反应24 h。反应结束后，测定样品中硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)含量[14]。

1.2.7奇亚籽提取物对AAPH诱导BSA氧化降解的影响

在BSA终浓度为0.5 mg/mL的反应体系中，先加入不同浓度的奇亚籽提取物，再加入终浓度为100 mmol/L的AAPH溶液，于37℃水浴反应6 h。反应结束后，取100 μL反应液转移至1.5 mL离心管中，加入25 μL 5×SDS凝胶电泳上样缓冲液，100℃加热变性10 min，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色30 mim并采用脱色液进行脱色；使用Chemi DocTMXRS化学发光成像系统进行凝胶成像[14]。

1.2.8总多酚和总黄酮含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定奇亚籽中总多酚含量，以没食子酸为标准品[11]，以没食子酸当量表示(mg GAE/g干重)；采用Al (NO3)3-NaNO2比色法测定奇亚籽中总黄酮含量，以芦丁为标准品，结果表示为芦丁当量(mg RE/g干重)[11]。

1.2.9统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，数据表示为平均值±标准差。各组间的差异比较采用独立样本t检验，以P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和极显著。

2结果与分析

2.1奇亚籽提取物对DPPH·的清除作用

如图1所示，白色和黑色奇亚籽提取物均能有效清除DPPH·，且清除率随奇亚籽提取物添加浓度的增大而升高，呈现良好的剂量-效应关系。经计算，在1.2.2所述试验体系中，白色和黑色奇亚籽提取物清除DPPH·的IC50值分别为(11.55±0.21) mg/mL和(18.18±1.03) mg/mL，且存在极显著差异(P<0.01)。

图1　奇亚籽提取物对DPPH·的清除作用Fig.1　DPPH· radical scavenging activity of the chia seeds extracts

以Trolox为对照品绘制标准曲线(图2)，白色和黑色奇亚籽的Trolox当量分别为(9.54± 0.14) μmol Trolox/g和(7.86±0.77) μmol Trolox/g。统计学分析表明，白奇亚籽的Trolox当量显著高于黑奇亚籽(P<0.01)。

图2　Trolox对DPPH·的清除作用Fig.2　DPPH· radical scavenging activity of trolox

2.2奇亚籽提取物对ABTS+·的清除作用

ABTS是一种化学性自由基引发剂，能够被过硫酸钾(K2S2O8)氧化并生成稳定的蓝绿色阳离子自由基(ABTS+·)。抗氧化物质可将蓝绿色ABTS+·还原为无色的ABTS分子形式，通过检测ABTS+·在734 nm吸光度的变化即可评价其抗氧化活性[15]。如图3所示，白色和黑色奇亚籽提取物均能有效清除ABTS+·，且清除率随添加浓度的增加而升高，呈良好的剂量-效应关系。经计算，在1.2.3所述试验体系中，白奇亚籽和黑奇亚籽提取物对ABTS+·的IC50值分别为(4.39±0.04) mg/mL和(6.92±0.08) mg/mL，且白奇亚籽提取物对ABTS+·的清除能力显著高于黑奇亚籽提取物(P<0.01)。

图3　奇亚籽提取物对ABTS+·的清除作用Fig.3　ABTS+· radical scavenging capacity of the chia seeds extracts

2.3奇亚籽提取物的铁离子还原能力(FRAP)

铁离子还原法(FRAP)的原理是：在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTZ(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+-TPTZ，使反应液变成深蓝色，在593 nm处有最大光吸收，这样通过测量样品吸光度的变化来测量其抗氧化能力，结果常表示为Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力[10]。由图4可知，随着2种奇亚籽提取物添加浓度的增加，反应液在593 nm吸光度逐渐升高，即铁离子还原能力逐渐升高。以FeSO4·7H2O为标准物质绘制标准曲线，求得白奇亚籽和黑奇亚籽的FeSO4·7H2O当量分别为(41.48+2.84) μmol/g和(29.70±2.43) μmol/g，且存在极显著差异(P<0.01)。

图4　奇亚籽提取物的铁离子还原能力Fig.4　Ferric reducing antioxidant power of the chia seeds extracts

2.4奇亚籽提取物抑制亚油酸氧化引发的β-胡萝卜素漂白

β-胡萝卜素漂白法(β-carotene bleaching test)主要用于评价样品在乳化脂质体系中的抗氧化能力，其原理是：乳状液中的亚油酸经自动氧化生成的自由基可引起β-胡萝卜素的黄色衰减(在470 nm处吸光度减小)，且吸光度随时间的延长而逐渐降低；当存在抗氧化剂时，β-胡萝卜素漂白的速率被减缓[16]。由图5可知，白奇亚籽和黑奇亚籽提取物均能显著抑制亚油酸氧化引起的β-胡萝卜素漂白。当添加浓度分别为20、30和40 mg/mL时，白亚籽提取物的抗氧化活性显著高于黑奇亚籽提取物(P<0.05)。

图5　采用β-胡萝卜素漂白法评价奇亚籽提取物的抗氧化能力Fig.5　Antioxidant activity of chia seeds extracts using the β-carotene bleaching assay注：与同浓度黑奇亚籽提取物组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5奇亚籽提取物对亚油酸过氧化的抑制作用

亚油酸是一种必需的ω-6不饱和脂肪酸，极易在空气中发生氧化。本研究采用Fe2+/VitC体系产生的羟基自由基(·OH)诱导亚油酸发生过氧化反应，并以TBARS为指标评价奇亚籽提取物对亚油酸过氧化的抑制作用。

由图6可知，在无Fe2+/VitC条件下，亚油酸自氧化反应较为缓慢，其TBARS含量较低[(4.24±0.47)至(5.11±1.14) μmol/L]。在Fe2+/VitC所产生的羟基自由基(·OH)作用下，与空白组相比，模型组样品中TBARS含量显著升高(P<0.01)。在Fe2+/VitC诱导亚油酸过氧化反应体系中分别加入终浓度为50、100、150和200 μg/mL的奇亚籽提取物均能够显著抑制TBARS的生成，且抑制作用随奇亚籽提取物添加浓度的升高而增强，呈良好的剂量-效应关系。

图6　奇亚籽提取物对Fe2+/VitC诱导亚油酸氧化的抑制作用Fig.6　Inhibitory effects of chia seeds extracts on Fe2+/VitC-mediated linoleic acid oxidation注：与空白组相比，**P<0.01；与Fe2+/VitC模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

2.6奇亚籽提取物对AAPH诱导蛋白氧化降解的抑制作用

蛋白质是自由基攻击的重要目标，自由基介导的蛋白质氧化损伤已被证实参与了多种疾病的发生和衰老过程[17]。自由基对蛋白质的损伤作用主要包括肽链断裂、蛋白质分子间交联聚合、氨基酸残基修饰等。本研究采用AAPH热分解产生的自由基攻击BSA蛋白，使其多肽链发生断裂并生成小分子质量的肽链；经考马斯亮蓝R-250染色后，原始蛋白条带信号减弱，据此评价蛋白质氧化降解的程度。

图7　奇亚籽提取物对AAPH诱导BSA蛋白氧化降解的影响Fig.7　Effects of chia seeds extracts on AAPH-induced BSA oxidative degradation

由图7可知，与空白组相比，模型组BSA蛋白与100 mol/L AAPH于37 ℃反应6 h后发生明显的氧化降解，导致其在66 kDa条带减弱。与模型组相比，两种奇亚籽提取物均能够有效抑制AAPH诱导的BSA氧化降解，且抑制作用随奇亚籽提取物添加浓度的升高而增强，呈现良好的剂量-效应关系。

2.7奇亚籽中总多酚和总黄酮含量

采用Folin-Ciocalteu法测得白奇亚籽和黑奇亚籽中总多酚含量分别为(3.40±0.09) mg CAE/g和(2.97±0.07) mg CAE/g；白奇亚籽和黑奇亚籽中总黄酮含量分别为(1.24±0.06) mg RE/g和(1.07±0.08) mg RE/g。统计学分析表明，白奇亚籽中总多酚和总黄酮含量均显著高于黑奇亚籽(P<0.05)，这与白奇亚籽提取物抗氧化活性强于黑奇亚籽提取物的试验结果相一致。

3结论与讨论

因营养丰富、食用价值高并具有多种健康促进作用，奇亚籽成为了当前食品营养领域的研究热点。2009年，欧洲食品安全局(EFSA)等多个权威组织对奇亚籽营养、健康功效和安全性进行了系统的的评价，认为在面包中添加5%的奇亚籽不会危害消费者健康[18]。在我国，根据国家卫生计生委于2014年5月发布的《关于批准塔格糖等6种新食品原料的公告》，奇亚籽被批准为新食品原料，其使用范围仅不能包括婴幼儿食品。目前，国外对奇亚籽的研究多集于其加工特性和产品开发[19-20]，而国内对奇亚籽的研究则刚刚起步。本文采用多种抗氧化试验方法评价了白色奇亚籽和黑色奇亚籽提取物的体外抗氧化活性。试验结果表明，奇亚籽是一种重要的天然抗氧化剂和功能食品原料来源，在食品工业领域极具开发潜力。

[1]KROGERUS K, GIBSON B R. 125thAnniversary review: diacetyl and its control during brewery fermentation[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2013, 119 (3): 86-97.

[1]ROBERTS R A, LASKIN D L, SMITH C V, et al. Nitrative and oxidative stress in toxicology and disease[J]. Toxicological Sciences, 2009, 112 (1): 4-16.

[2]VETRANI C, COSTABILE G, DI MARINO L, et al. Nutrition and oxidative stress: a systematic review of human studies[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2013, 64 (3):312-326.

[3]FINLEY J W, KONG A N, HINTZE K J, et al. Antioxidants in foods: state of the science important to the food industry [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59 (13): 6 837-6 846.

[4]BERGER R G, LUNKENBEIN S, STRÖHLE A, et al. Antioxidants in food: mere myth or magic medicine? [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52 (2): 162-171.

[6]MOHD Al N, YEAP S K, HO W Y, et al. The promising future of chia,SalviahispanicaL [J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, 2012(1):171 956.

[7]MOREIRA R, CHENLO F, TORRES M D. Effect of chia (SativahispanicaL.) and hydeocolloids on the rheology of gluten-free doughs based on chestnut flour[J]. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50 (1): 160-166.

[9]LI Q, YU N W, WANG Y P, et al. Extraction optimization ofBruguieragymnorrhizapolysaccharides with radical scavenging activities[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 96 (1): 148-155.

[10]BENZIE I F F, STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay [J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239 (1): 70-76.

[11]AKTUMSEK A, ZENGIN G, GULER G O, et al. Assessment of the antioxidant potential and fatty acid composition of fourCentaureaL. taxa from Turkey[J]. Food Chemistry, 2013, 141 (1): 91-97.

[12]DAPKEVICIUS A, VENSKUTONIS R, VAN BEEK T A, et al. Antioxidant activity of extracts obtained by different isolation procedures from some aromatic herbs grown in Lithuania[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1998, 77 (1): 140-146.

[13]KAWAI Y, FUJII H, OKADA M, et al. Formation of Nε-(succinyl)lysineinvivo: a novel marker for docosahexaenoic acid-derived protein modification[J]. Journal of Lipid Research, 2006, 47 (7): 1 386-1 398.

[14]XIANG Q S, LIU Q, XU L, et al. Carnosic acid protects biomolecules from free radical-mediated oxidative damageinvitro[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22 (5): 1 381-1 388.

[15]RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26 (9/10): 1 231-1 237.

[16]KULISIC T， RADONIC A, KATALINIC V, et al. Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil[J]. Food Chemistry, 2004, 85 (4): 633-640.

[17]BARAIBAR M A, LIU L, AHMED E K, et al. Protein oxidative damage at the crossroads of cellular senescence, aging, and age-related diseases[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2012, 2012: ID 919832.

[18]BRESSON J L, FLYNN A, HEINONEN M, et al. Opinion on the safety of “Chia seeds (SalviahispanicaL.) and ground whole Chia seeds” as a food ingredient[J]. The European Food Safety Authority Journal, 2009(996): 1-26.

[19]STEFFOLANI E, MARTINEZ M M, LEN A E, et al. Effect of pre-hydration of chia (SalviahispanicaL.), seeds and flour on the quality of wheat flour breads [J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 61 (2): 401-406.

Evaluation of antioxidant capacity of chia seeds extractsinvitro

XIANG Qi-sen1, 2, SHI Guo-qing1, 2, ZHAO Zhen-yu1, 2, MA Yun-fang1, 2,CUI Xi-xi1, 2, SHEN Rui-ling1, 2*

1(College of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)2 (Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety, Zhengzhou 450002, China)

ABSTRACTChia seeds are derived from the Salvia hispanica plant, which can offer various health benefits. The in vitro antioxidant potential, total phenolic and total flavonoid contents of white and black chia seeds were evaluated. All the investigated chia extracts exhibited dose-dependent DPPH· and ABTS+·radical radical-scavenging activities. The white chia seeds extracts exhibited much higher DPPH· and ABTS+·radical-scavenging activity than that of black chia seeds. The reducing capabilities of white and black chia extracts were (41.48+2.84) μmol/g and (29.70±2.43) μmol/g, respectively. Both extracts effectively inhibited linoleate free radical-mediated bleaching of β-carotene. In addition, the extracts significantly inhibited free radical-mediated linoleic acid peroxidation and the oxidative degradation of bovine serum albumin. The total phenolic contents of white and black chia seeds were (3.40±0.09) mg CAE/g and (2.97±0.07) mg CAE/g, respectively. The total flavonoid contents of white and black chia seeds were (1.24±0.06) mg RE/g and (1.07±0.08) mg RE/g, respectively. These results suggest that chia seeds could be considered as a good source of natural antioxidants and functional food ingredients, and offer a huge potential used in food industry.

Key wordschia seeds; antioxidants; free radicals; ferric reducing antioxidant power

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606035

基金项目：河南省高等学校重点科研项目(No.15A550024)；郑州轻工业学院博士科研基金资助项目(No.2013BSJJ079)

收稿日期：2015-07-31，改回日期：2015-12-03

第一作者：博士，讲师(申瑞玲教授为通讯作者，E-mail: shenrl1967@163.com)。