鱼鳞胶原蛋白基抗菌凝胶的抑菌效果

叶忱,王喆,钟青萍

1(华南农业大学 食品学院，广东 广州,510642)2(中国科学院 深圳先进技术研究院医药所，广东 深圳,518055)



鱼鳞胶原蛋白基抗菌凝胶的抑菌效果

叶忱1,2,王喆2,钟青萍1 *

1(华南农业大学 食品学院，广东 广州,510642)2(中国科学院 深圳先进技术研究院医药所，广东 深圳,518055)

摘要采用96孔板法探究了牛至精油、溶菌酶和茶多酚3种天然抑菌剂对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC),同时采用吸光度法测定了抑菌率。结果发现，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对E. coli的MIC分别为2.5 μL/mL、6.25 mg/mL和0.156 mg/mL，MBC分别为2.5 μL/mL、25 mg/mL和0.156 mg/mL,抑菌率分别为87.53%、49.26%和79.81%；对S.aureus的MIC分别为1.25 μL/mL、12.5 mg/mL和0.156 mg/mL，MBC分别为2.5 μL/mL、25 mg/mL和0.156 mg/mL，抑菌率分别为83.22%、51.16%和75.22%。可见添加3种天然抑菌剂的鱼鳞胶原蛋白凝胶对E.coli和S.aureus均有明显的抑制作用，且MIC均是：茶多酚<牛至精油<溶菌酶，抑菌率均是：牛至精油>茶多酚>溶菌酶，抑菌效果均是：茶多酚>牛至精油>溶菌酶。因此，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶具有较好的抑菌效果和应用前景。

关键词天然抑菌剂；最小抑菌浓度(MIC)；最小杀菌浓度(MBC)；鱼鳞胶原蛋白凝胶；96孔板

近年来随着人们的卫生、安全意识的增强，抑菌剂的选择逐渐倾向于既可以抑制细菌的生长又健康安全的天然抑菌剂。其中牛至精油是从牛至中提取的挥发性植物精油，含有芳香酚类、萜类、鞣酸、树脂等多种化学成分，具有很强的杀菌抑菌及抗氧化作用[1-3]。溶菌酶是一种天然缩氨酸蛋白质抑菌剂，通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细菌的细胞壁分解而抑制细菌活性，可作为抑菌酶添加到包装材料中[4-5]。茶多酚是茶叶中酚类物质及衍生物的总称，其中主体儿茶素类为2-苯基苯并吡喃的衍生物[6-7]，现代科学已证实它有止渴提神、延缓衰老[8-9]、抗肿瘤和抗辐射[10]等作用，是很强的天然抗氧化剂，同时对微生物具有较强的抑制作用[11-14]，现已大量应用于食品、医疗、日用化工、轻工等多方面[15-19]。

本文以鱼鳞胶原蛋白凝胶为基质，分别添加具有抑菌活性的牛至精油、溶菌酶和茶多酚制成抗菌凝胶，用做可食涂膜包装。本研究采用96孔板法探究鱼鳞胶原蛋白抗菌凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。相比于传统的试管二倍梯度稀释法，96孔板法更清晰直观，操作简易，工作效率高。本文旨在为牛至精油、溶菌酶和茶多酚作为天然抑菌剂应用于可食抗菌包装中提供参考。

1材料与方法

1.1菌株、材料与试剂

大肠杆菌(Escherichiacoli, ATCC25922)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, ATCC25923)，由中国科学院深圳先进技术研究院人体组织与器官退行性研究中心提供。

鱼鳞胶原蛋白凝胶，中国科学院深圳先进技术研究院人体组织与器官退行性研究中心；营养琼脂、营养肉汤，广东环凯试剂有限公司；牛至精油，苏州诗妍生物日化有限公司；溶菌酶，成都艾科达化学试剂有限公司；茶多酚，上海易蒙斯化工科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Thermo Scientific Multiskan GO全波长读数仪，北京金业德祥生物科技有限公司；VS-1300L-U超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；DNP-9082电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；GR110DR Zealway 110L智能灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1标准曲线的绘制

细菌的菌浓度与吸光度(OD)值之间存在线性关系[20]。测定不同稀释度的细菌悬液在600 nm处OD值，采用平板菌落计数方法确定不同稀释度细菌悬液的浓度，最后以OD值为纵坐标，以菌浓度为横坐标作出标准曲线。

1.3.2配制抑菌工作液

在无菌环境下分别称取20 μL牛至精油、200 mg溶菌酶和20 mg茶多酚，加入5 g胶原蛋白，并用营养肉汤配制成浓度分别为20 μL/mL的牛至精油工作液、200 mg/mL的溶菌酶工作液和20 mg/mL的茶多酚抑菌工作液。

1.3.3最小抑菌浓度(MIC)

在无菌的96孔板A-F排每孔中各加入180 μL营养肉汤，吸取180 μL预先配制的牛至精油抑菌工作液至D1孔中混合均匀，D1孔浓度即为10 μL/mL；从D1孔吸取180 μL溶液到D2孔，依次稀释到D11孔，D11孔弃去180 μL溶液(吸取前注意混合均匀)，D12孔为空白对照；以相同的条件分别在E、F排添加溶菌酶和茶多酚抑菌工作液；接下来在D、E、F每孔中加入10 μL菌悬液(104CFU/mL)，最后在37 ℃下培养24 h后观察，同时做3次平行实验。抑菌液浓度最低且澄清的孔所对应的即为最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.4最小杀菌浓度(MBC)

将浓度高于MIC(包括MIC)的孔中溶液各吸取100 μL涂布平板，37 ℃培养24 h后观察，仍无菌生长的平板所对应的浓度即为最小杀菌浓度(MBC)。

1.3.5吸光度测定抑菌率

(1)

1.3.6数据分析

采用Microcal Origin 8.1和SPSS 17.0进行方差分析和显著性分析。

2结果与分析

2.1标准曲线

细菌菌悬液的OD值与其浓度存在线性正比关系。在600 nm处测定细菌菌悬液的OD值，再根据活菌计数法计算每毫升菌悬液中的细菌数目，以OD值为纵坐标，菌浓度为横坐标，得到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液浓度与OD值的标准曲线，如图1、图2所示。

图1　大肠杆菌悬液浓度与OD值的标准曲线Fig.1　The standard curve between E. coli suspension concentration and OD values

图2　金黄色葡萄球菌悬液浓度与OD值的标准曲线Fig.2　The standard curve between S.aureus suspension concentration and OD values

由图1可知，大肠杆菌的菌悬液标准曲线关系式为：y=0.302x+ 0.029，拟合度R2为0.999，说明该曲线的可信度高。由图2可知，金黄色葡萄球菌的菌悬液标准曲线关系式为：y=0.026x+ 0.122，拟合度R2为0.999，说明该曲线的可信度高。根据这2条标准曲线，在实验中可以根据OD值制备出实验所需浓度的菌悬液。

2.2最小抑菌浓度(MIC)

如图3所示，可以分别观察到添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的抑菌效果。由图可知，牛至精油(D行)、溶菌酶(E行)和茶多酚(F行)工作液所对应的第3个孔(D行)、第5个孔(E行)和第7个孔(F行)澄清，且效果明显。由此可得出结论，含有牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为2.5 μL/mL、6.25 mg/mL和0.156 mg/mL。

图3　鱼鳞胶原蛋白抗菌凝胶对大肠杆菌的最小抑菌浓度Fig.3　MIC of the scale collagen antimicrobial gel for E. coli注：A、B和C排为空白对照，即仅添加了牛至精油工作液、溶菌酶工作液和茶多酚工作液；D、E和F排则是：工作液+大肠杆菌菌悬液(104CFU/mL)。

如图4所示，可以分别观察到添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。由图4可知，牛至精油(D行)、溶菌酶(E行)和茶多酚(F行)工作液所对应的第4个孔(D4)、第4个孔(E4)和第7个孔(F7)澄清，且效果明显。由此可得出结论：含有牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.25 μL/mL、12.5 mg/mL和0.156 mg/mL。

图4　鱼鳞胶原蛋白抗菌凝胶对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度Fig.4　MIC of the scale collagen antimicrobial gel for S.aureus注：A、B和C排为空白对照，即仅添加了牛至精油工作液、溶菌酶工作液和茶多酚工作液；D、E和F排则是：工作液+金黄色葡萄球菌菌悬液(104 CFU/mL)。

2.3最小杀菌浓度(MBC)

2.3.1含牛至精油的鱼鳞胶原蛋白凝胶最小杀菌浓度(MBC)

图5中编号1～3牛至精油浓度分别为10、5、2.5 μL/mL，37 ℃培养24 h后，1～3号平板仍无菌生长，由此可知，含牛至精油的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度为2.5 μL/mL。

图5　含牛至精油的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.5　MBC of the scales collagen gel containing oregano essential oil for E. coli

图6中编号1～4牛至精油浓度分别为10、5、2.5、1.25 μL/mL，37 ℃培养24 h 后，1～3号平板仍无菌生长，由此可知，含牛至精油的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度为2.5 μL/mL。

图6　含牛至精油的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.6　MBC of the scales collagen gel containing oregano essential oil for S.aureus

2.3.2含溶菌酶的鱼鳞胶原蛋白凝胶最小杀菌浓度(MBC)

图7中编号1～5溶菌酶浓度分别为100、50、25、12.5、6.25 mg/mL，37 ℃培养24 h后，1～3号平板仍无菌生长，由此可知，含溶菌酶的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度为25 mg/mL。

图7　含溶菌酶的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.7　MBC of the scales collagen gel containing lysozyme for E. coli

图8中编号1～4溶菌酶浓度分别为100、50、25、12.5 mg/mL，37 ℃培养24 h后，1～3号平板仍无菌生长，由此可知，含溶菌酶的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度为25 mg/mL。

图8　含溶菌酶的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.8　MBC of the scales collagen gel containing lysozyme for S.aureus

2.3.3含茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶最小杀菌浓度(MBC)

图9中编号1～7茶多酚浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL，37 ℃培养24 h后，1～7号平板仍无菌生长，由此可知，含茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度为0.156 mg/mL。

图9　含茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.9　MBC of the scales collagen gel containing tea polyphenols for E.coli

图10中编号1～7茶多酚浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL，37 ℃培养24 h后，1～7号平板仍无菌生长，由此可知，含茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度为0.156 mg/mL。

图10　含茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)Fig.10　MBC of the scales collagen gel containing tea polyphenols for S.aureus

2.4抑菌率

2.4.1三种抑菌剂对大肠杆菌的抑菌率

由表1可知，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌的抑菌率分别为87.53%、49.26%和79.81%。可见添加这3种抗菌剂的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌抑菌效果明显，且抑菌率为：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。

表1　三种抑菌剂在大肠杆菌最小抑菌浓度下

2.4.2三种抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑菌率

由表2可知，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别是83.22%、51.16%和75.22%。可见添加这3种抗菌剂的鱼鳞胶原蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，且抑菌率为：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。

表2　三种抑菌剂在金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度下

3结论

添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对试验所用的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定程度的抑制作用，且随着添加量的增加，抑菌能力增强。最小抑菌浓度为：茶多酚<牛至精油<溶菌酶，抑菌率为：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。由此可知：添加牛至精油和茶多酚的鱼鳞胶原蛋白凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力优于溶菌酶，本实验的研究结果为牛至精油、溶菌酶和茶多酚在可食抗菌包装的应用提供一定的参考。

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Antibacterial effects of scale collagen protein-based antibacterial gel

YE Chen1,2, WANG Zhe2, ZHONG Qing-ping1*

1(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)2(Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China)

ABSTRACT96-well plate method was used to determine minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, while the inhibition rate was determined by the absorbance method. It was found that the MICs of oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols for E. coli were 2.5 μL/mL, 6.25mg/mL and 0.156 mg/mL, the MBCs were 2.5 μL/mL, 25 mg/mL and 0.156 mg/mL, wherein inhibition rates were 87.53%, 49.26% and 79.81%. The MICs of S.aureus were 1.25 μL/mL, 12.5 mg/mL and 0.156 mg/mL, the MBCs were 2.5μL/mL, 25mg/mL and 0.156mg/mL, wherein inhibition rates were 83.22%, 51.16% and 75.22%, respectively. Results indicated that scale collagen gel enriched with three natural antibacterial agents had significant inhibition effects against E. coli and S.aureus, the order of MICs for E. coli and S.aureus was as follows: tea polyphenols < oregano essential oil < lysozyme. The order of their antibacterial rate was as follows: oregano essential oil> tea polyphenols> lysozyme. The order of their inhibitory effects was as folows: tea polyphenols > oregano essential oil >lysozyme. This study showed that the scale collagen gel enriched with oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols had strong antibacterial effects and application prospects.

Key wordsnatural antibacterial agents; MIC; MBC; scale collagen gel; 96-well plate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606019

基金项目：国家自然科学基金项目(31271956)；深圳市2014年科技研发基础研究项目(JCYJ20140901003939008)；2014年青年创新创业"成长之星"项目(KC2014JSQN0009A)

收稿日期：2015-12-07，改回日期：2016-02-29

第一作者：硕士研究生(钟青萍教授为通讯作者，E-mail：zhongqp@scau.edu.cn)。