基于电子鼻技术监测金耳深层发酵

黄星奕，陈茂晴，张志才，王顺，潘思慧

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)



基于电子鼻技术监测金耳深层发酵

黄星奕，陈茂晴，张志才，王顺，潘思慧

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)

摘要利用电子鼻技术监测金耳深层发酵过程尾气变化，实现对金耳液体发酵过程的监测。优选出7根对金耳发酵液挥发性组分敏感的TGS系列气敏传感器。对所得数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)、模糊C均值聚类分析(fuzzy c-means method，FCM)和K最近邻分析(K-nearest neighbors analysis，KNN)，通过主成分分析和模糊C均值聚类分析可以准确区分金耳的3个生长阶段。KNN模型在预测集和验证集中均对发酵阶段取得了较为理想的识别结果。实验结果表明，电子鼻技术可以有效监测金耳深层发酵过程状态。

关键词电子鼻；金耳；发酵监控；尾气

金耳是中国特有的稀有菌种，主要分布于西藏、云南等地，在我国拥有悠久的食用药用历史，古籍记载金耳可用于肺热、痰多、咳嗽等症的治疗[1]。从20世纪后期开始，研究人员对金耳的培育、液体深层发酵、代谢产物进行了大量的研究，深入了解了金耳多糖的化学组分与功效[2]。近年来，液体深层发酵技术在金耳多糖的提取上有了众多成功的应用[3]。但发酵过程异常复杂，依靠现有技术难以充分保障发酵过程安全。尾气作为菌体代谢产物，可以全面表征微生物在发酵罐内的生理状态变化，选择合适的技术手段监测尾气变化就具有十分重要的意义。

电子鼻是近些年发展起来的一种仿生嗅觉技术，与传统的分析检测仪器不同，其检测结果为挥发性组分的整体信息[4]，需要对原始数据进行进一步的数据处理，通过各种化学计量学方法进行模式识别分析。近年来，研究人员将电子鼻应用于发酵监控领域，NABARUM[5]等利用电子鼻技术在线监控黑茶发酵确定了黑茶发酵的最佳时间，江辉[6]等人采用电子鼻技术较好识别了固态发酵的不同状态。目前国内外利用电子鼻监控液体发酵过程的文献较为少见，因此电子鼻技术应用于液体发酵过程监测具有重要的理论和应用意义。本研究利用自行搭建的电子鼻系统监测金耳发酵过程尾气的变化，尝试探索针对金耳发酵在线监测的新技术。

1材料与方法

1.1材料与试剂

菌种：金耳(Tremellaaurantialba)，由江苏大学应用微生物研究所提供；斜面培养基：PDA固体培养基；种子培养基：PDA液体培养基；发酵培养基：葡萄糖720 g,玉米粉270 g,麸皮360 g，蛋白胨72 g，KH2PO420 g，MgSO412 g，豆油70 mL。2 L双阀铝箔气体采样袋，大连德霖气体包装有限公司。

1.2仪器与设备

电子鼻系统，由江苏大学食品/农产品品质无损检测技术研究中心自主研制。20 L自动机械搅拌发酵系统，镇江格瑞生物工程有限公司；发酵控制参数：装液量70%，搅拌速度90 r/min, 罐压0.05 MPa，罐内温度28 ℃。

1.3样本处理

金耳接种培养后，每隔24 h采集尾气样本10个，同时提取适当发酵液用于分析菌体干重。整个金耳发酵阶段共取尾气样本70个。共进行2个批次的金耳发酵试验，第2批次样本用于模型验证。

1.4测定指标及方法

1.4.1菌体干重(dry cell weight,DCW)

取出发酵液后适当静置，用40目不锈钢滤网过滤金耳发酵液，去除发酵液中的麸皮。然后使用高速冷冻离心机9 000 r/min离心10 min,蒸馏水洗涤2次，收集沉淀物，60 ℃烘干至恒重即为菌体干重。

1.4.2电子鼻检测

电子鼻的工作流程为：抽气泵先将尾气吸入传感器阵列反应室，然后由数据采集模块得到传感器阵列的响应数据，最后通过模式识别算法得到分析结果。电子鼻系统检测尾气样本的具体参数设置如下。

表1　电子鼻检测参数

1.5数据处理

提取电子鼻响应的稳定值作为特征数据。主要分析方法：主成分分析(principal component analysis，PCA)、K邻分类算法(K-nearest neighbors，KNN)[7]、模糊C均值聚类方法(fuzzy c-means，FCM)[8]。本研究数据分析在Matlab 2012a(Mathworks，USA)平台上完成。

2结果与分析

2.1电子鼻传感器优选

2.1.1传感器初选

已有科研人员分析了金耳发酵液挥发性组分[9]，其中主要包括醇类、烃类、酯类和倍半萜类芳香化合物。日本费加罗公司生产的TGS系列传感器性能较为稳定，寿命长，具有极高的灵敏性，对多种气体组分具有一定的广谱响应特性。初步筛选12根TGS系列的气敏传感器用于金耳发酵尾气监控，型号分别为TGS825、TGS832、TGS831、TGS822、TGS813、TGS816、TGS880、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。然而由于气体组分十分复杂，传感器响应信息中包含大量冗余，因而需要进一步优选传感器。

2.1.2相对变化值分析

计算12根传感器在整个发酵阶段响应的相对变化均值，传感器TGS831的相对变化值均值小于100，可认为该传感器对发酵阶段尾气不敏感，故剔除此传感器。

2.1.3相关性分析和变异系数分析

相关性分析用来表征不同传感器的相关程度，若两个传感器之间相关性分析结果较大，则说明传感器响应存在重复，进而可以选择合适的参数比较方法去除一个传感器消除部分冗余信息，简化气敏传感器阵列的构成。变异系数(Coefficient of Variation,CV)反映了传感器的稳定性，变异系数值越大，说明传感器检测结果的离散程度越大，其可靠性越差，予以剔除。

表2　传感器响应相对变化均值

通过对余下的11根传感器进行相关性分析，在置信度为95%的基础上，传感器TGS832、TGS822、TGS813任意两根传感器之间的相关性在0.95以上，TGS816、TGS880、TGS2600任意两根传感器之间的相关性也在0.95以上，可以认为以上两组传感器分别对尾气具有相似的敏感性。然后，分别对以上两组相关性较强的传感器进行变异系数分析， TGS832和TGS2600的变异系数明显低于其他传感器，详见表3，可以认为这两根传感器相较其他几根具有更好的稳定性。

表3　传感器变异系数分析

综合以上传感器优选方法，选出如下7根气敏传感器构成电子鼻传感器阵列，分别为：TGS825、TGS832、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。

2.2菌体干重变化分析

菌体干重常用于衡量发酵液中的生物量，该指标和菌体生长有重要关系。由图1知，可根据菌体生长情况将金耳液体发酵分为3个阶段，第1天为第1阶段，发酵液中菌体质量增加并不明显。第2～4天为对数生长期，菌体质量呈指数增加。从第5天开始，金耳菌丝体质量趋于稳定，这是由于菌体的繁殖数量和死亡数量大致平衡。一般选择稳定期为收获期，故而选择在第7天下罐结束发酵。

图1　菌体干重变化Fig.1　The change of DCW

2.3电子鼻检测

2.3.1主成分分析

前3个主成分的累计贡献率达到94.66%，代表了大部分的电子鼻特征信息。图2 为前3个主成分的得分图，表现为样本点在三维平面上的投影。第1天的尾气样本较为分散，因为接种后的第1天金耳菌丝体未完全适应新环境，生长缓慢，尾气中也无明显芳香气味。第2～4天的样本聚类趋势明显，这一阶段中金耳菌体生长速度明显加快，相互缠绕形成球状菌团，且随着发酵进程推进菌团体积逐渐增大，发酵液颜色不断加深，尾气中的芳香气味也越来越浓郁。第5～7天的样本在图中位置较为接近，这是因为当发酵进行到第5天时，金耳菌丝体生长速度放缓，球状菌团的体积无显著变化，尾气中挥发性组分相对恒定，其浓郁程度已接近最高。第6、第7两天的样本重叠现象严重，这是因为到了最后两天菌体生长增殖趋于停滞，其代谢产物相对恒定。通过主成分分析，了解了金耳发酵不同发酵阶段尾气成分的变化特征，可以明显的将金耳生长分为3个阶段，该结果不仅与菌体量变化趋势相吻合，也符合人工生产经验。

图2　主成分分析Fig.2　Principal component analysis

2.3.2FCM分析

对所有的尾气样本进行标号，例如第1天的第1个样本记为1-1，依次类推。FCM分析时，设置幂指数为3，最大迭代次数为200，目标函数的终止容限为1×10-6。结果如表4所示，FCM算法共将金耳发酵分为3个阶段，接种的第1天为第1阶段，第2～4天为第2阶段，第5～7天为第3阶段。该分类结果与PCA分类结果一致。

表4　FCM分类结果

2.3.3KNN分析

在主成分分析的基础上，利用KNN进行分析。首先将尾气样本分为7类，同一天的样本作为一类，随机选择49个样本作为训练集的样本，余下的21个为测试集的样本。KNN模型的输入量为主成分得分，输出量为不同发酵阶段。不同的k值和不同的主成分数会对模型的识别结果造成较大影响，需要对其进行优化，利用模型预测结果的识别率来衡量模型的性能。当K=5，主成分数为7时，模型达到最优，图3表明此时预测集识别准确率达到94.95%。如果将样本分为3类，即对应金耳发酵的3个阶段，当K=2，主成分数为3时，模型最优，该模型的识别准确率达到100%，详见图4。

图3　分为7类的预测结果Fig.3　The prediction result of seven categories

图4　分为3类的预测结果Fig.4　The prediction result of three categories

第1批金耳发酵试验结束后，进行了第2批次的金耳发酵试验，条件与第1批次保持一致。利用基于第1批数据建立的预测模型对第2批次发酵进行预测分析。与第1批次相同，也按2种方法对发酵阶段进行分类，第1种是将发酵的每一天当成1个阶段，共分为7个阶段，第2种分类方法是将金耳发酵阶段分为第1天、第2～4天和第5～7天共3个阶段。表5表明，当分为3个阶段时，识别准确率达到80%。当分为7个阶段时，其识别准确率较低为64.29%，由于发酵过程的复杂性，该识别结果亦可以接受。

表5　第2批发酵预测结果

3结论

本研究利用电子鼻监控了金耳发酵过程尾气变化。首先优选出7根对金耳发酵液挥发性组分较为敏感的TGS系列传感器。采用PCA、KNN和FCM等模式识别算法分析电子鼻数据，通过PCA和FCM可以准确区分金耳菌丝体的3个生长代谢阶段。在预测集中，KNN对不同发酵阶段达到较高的识别准确率。在验证集中，当发酵分为3个阶段时，模型达到了80%的识别准确率，当模型分为7个阶段时，识别准确率略低。电子鼻技术在识别金耳深层发酵过程状态方面取得了较为理想的结果，结果表明，该技术在发酵过程监测方面拥有一定的应用前景。本研究为以后研发专用于金耳发酵过程监测的便携式电子鼻系统奠定了基础。

参考文献

[1]张雯,瞿伟菁,张晓玲,等.金耳菌丝体多糖降血糖作用研究[J].营养学报,2004(4):300-303.

[2]谢红,刘春卉,苏槟楠,等.金耳8254的营养价值和药理研究[J].中国食用菌, 2000,19(6):39-41.

[3]汪虹,瞿伟菁,曹群华.金耳的液体发酵研究[J].食用菌报,2003(4):29-33.

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[9]张志才,章克昌,俞建国,等.利用GC-MS技术分析金耳发酵液挥发性成分[J].天然产物研究与开发,2007,19(5):822-826.

Monitoring ofTremellaaurantialbasubmerged fermentation using electronic nose

HUANG Xing-yi，CHEN Mao-qing，ZHANG Zhi-cai，WANG Shun，PAN Si-hui

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China)

ABSTRACTElectronic nose was used for monitoring the off-gas change of Tremella aurantialba broth to monitor the fermentation. And seven TGS gas sensors for volatile components were selected. The data was analyzed by principal component analysis(PCA)，fuzzy c-means method(FCM) and K-nearest neighbors analysis(KNN). The three stages of the growth of the Tremella aurantialba fermentation could be accurately distinguished by PCA and FCM. Good recognition results had been achieved in the prediction and validation set using KNN algorithm. The experimental results showed that the electronic nose system could effectively monitor the state of the liquid fermentation process.

Key wordse-nose; Tremella aurantialba; monitoring of fermentation; off-gas

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606018

基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201003008)；国家自然科学基金项目(31071549)；江苏省高校优势学科建设工程项目资助。

收稿日期：2015-10-28，改回日期：2016-02-19

第一作者：教授(本文通讯作者，E-mail：h_xingyi@163.com)。