肉桂醛和百里香酚对生料工艺酒精发酵的影响

王欣，许宏贤，周鹏，段钢

(杰能科(中国)生物工程有限公司，江苏 无锡，214028)



肉桂醛和百里香酚对生料工艺酒精发酵的影响

王欣，许宏贤，周鹏，段钢*

(杰能科(中国)生物工程有限公司，江苏 无锡，214028)

摘要肉桂醛和百里香酚具有较强的抑菌活性，常用于食品的保鲜和防腐，也可作为饲料添加剂。文中对肉桂醛和百里香酚对生料工艺酒精发酵的影响进行了研究。表明肉桂醛和百里香酚在酒精发酵中有一定的抑菌效果；以大米为原料时，10 μg/L的肉桂醛和50 μg/L的百里香酚使酒精产量分别提高了1.7%和0.7%；以玉米为原料时，50 μg/L的肉桂醛提高酒精产量2.0%，25 μg/L百里香酚提高1.43%；但如果继续提高肉桂醛和百里香酚的浓度，会抑制酵母的生长，导致酒精产量降低。

关键词肉桂醛；百里香酚；生料发酵；酒精

无蒸煮过程又称生料制酒也称一步发酵，是指在低于淀粉糊化的温度下用生料淀粉水解酶与酵母共同作用于淀粉质原料产生酒精的过程。无蒸煮过程工艺已经在欧美国家得到了商业上的广泛应用[1]，最有希望解决酒精生产中能耗高，效率低的问题。在酒精生产上，生料酶技术的使用，省去了高温蒸煮过程，由于减少了淀粉在高温时的损失，以及在生料酶的作用下系统中糖浓度很低，使得酵母产酒精的效率很高，因此淀粉转化率大大提高[2]。但是，值得注意的是，生料酒精发酵是在无蒸煮的情况下进行，存在染菌的危险，这是必须考虑的因素之一。有研究表明，从酒精发酵中分离出的细菌有乳杆菌属(Lactobacillus)、小球菌属(Pediococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和梭菌属(Clostridium)等[3]，几乎有2/3的所分离的细菌属于乳酸细菌,例如乳杆菌[4]。最近几年，DDGS中抗生素的残留问题越来越得到重视，所以应在酒精生产中尽量避免使用抗生素。

安惠华TMEO是杜邦工业生物科技部丹尼斯克动物营养最新推出的一种经过细致平衡、内含高浓度百里香酚和肉桂醛的混合物，可作为饲料添加剂用于仔猪多发病饲养，而由于肉桂醛和百里香酚具有良好的抑制真菌的效果，也广泛应用于食品加工和保存中的防腐保鲜，是中国、欧盟和美国都允许使用的食品添加剂。如果将安惠华TMEO应用到生料酒精生产中，能否达到抑制杂菌的生长，从而减少原料损失提高酒精产出，又能使安惠华TMEO在DDGS 中继续发挥作用从而提高饲料的营养价值，本文对此进行了研究。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验原料

全磨大米粉(泰国)；全磨玉米粉(中粮丰原燃料酒精有限公司提供)；安琪牌酿酒高活性干酵母(耐高温型)。

1.1.2主要酶制剂

高温淀粉酶：SPEZYME ALPHA，杰能科国际公司，酶活力129 766 wu/g；糖化酶：GA-L-NEW，杰能科国际公司，酶活力100 000 wu/g；生料酶STARGEN 002，杰能科国际公司，酶活力570 GAU/g。

1.1.3主要试剂

TSA培养基：德国默克公司；尿素：国药集团；无水乙醇、葡萄糖、麦芽糖、甘油、乳酸、乙酸均购自北京色谱中心，为色谱级。肉桂醛、百里香酚：国药集团；Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus购自CICC菌种中心

1.2实验设备

高压液相色谱，Agilent 1200系列；恒温循环器，赛默飞世尔科技(卡尔斯鲁厄)公司；显微镜，BX53F,配DT2000 真彩色图像分析系统；Quanta-2000电子显微镜，荷兰FEI公司制造。

1.3分析方法

1.3.1发酵醪组成测定

高效液相色谱法，Agilent HP1200 高效液相色谱仪,HP Chemstations色谱工作站,色谱柱Bio-rad 87H。色谱分离操作条件(常温下进行)流动相:0.005 mol/L H2SO4;流速 0.6 mL/min; 柱温60 ℃; 进样量20 μL。

1.3.2酵母数量的统计

血球计数法，取一定发酵液稀释，滴1滴在血球计数板上，在显微镜下进行统计，以每个血球计数板中格中有30～80个酵母为宜。

2结果与讨论

2.1安惠华TMEO101G 对乳杆菌的抑菌实验

有研究表明，在酒精发酵过程染有的杂菌中几乎2/3的为乳酸细菌，例如乳杆菌，故本文针对安惠华TMEO101G对乳杆菌的抑菌情况做了研究，取本实验室的Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus培养于添加了不同浓度的安惠华TMEO101G液态培养基中，培养24 h后观察，发现虽然安惠华TMEO101G的质量浓度在0.1～1 g/L时仍然有乳酸菌生长，但是其长势逐渐减弱，并且在质量浓度达到1.5 g/L时，已经没有乳杆菌生长。

表1　EO101G 对乳杆菌的抑制情况

2.2安惠华TMEO101G 对以大米为原料的生料发酵的影响

取一定量的全磨大米粉，以每个发酵三角瓶含100 g醪液计，加入33 g全磨大米和67 g自来水，加入安惠华TMEO101G，分别控制质量浓度在0.1，0.5,1和5 g/L，用26%的浓H2SO4调节pH为4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴锅中培养，培养70 h后取样采用HPLC测定发酵醪的组成和酒精含量。

由图1可以看出，在发酵前期安惠华TMEO101G的添加导致了22 h时酒精含量的降低，说明安惠华TMEO101G的添加造成了酒精发酵的延迟，但是随着酒精发酵的进行，0.1～1 g/L的EO101G对酒精发酵的抑制作用减弱，反而在发酵结束时增加了最终的酒精含量，EO101G质量浓度在1.0 g/L时酒精产量达到了15.98%vol，比对照(15.60%vol)提高了2.43%。但是EO101G的质量浓度增加到5 g/L时，完全抑制了生料酒精发酵，在发酵结束时也没有酒精的产生。

图1　EO101G 对大米原料生料酒精发酵的影响Fig.1　The effect of EO101G on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.3肉桂醛和百里香酚对大米生料发酵的影响

由于安惠华TMEO101G的有效成分主要为肉桂醛和百里香酚，故本文对肉桂醛和百里香酚分别对大米生料发酵的影响进行了研究，并且针对肉桂醛和百里香酚对发酵醪中酵母数量的影响进行了研究。

由图2可以看出肉桂醛和百里香酚的添加减少了发酵醪中的酵母数量，并且随着浓度的增加，发酵醪中的酵母数量逐渐降低，但这并没有影响其发酵效率，数据表明质量肉桂醛质量浓度在10 μg/L时酒精产量达到了15.80%vol，比对照(15.53%vol)提高了1.7%，百里香酚质量浓度在50 μg/L时酒精产量达到了15.65%vol，比对照(15.53%vol)提高了0.7%。但是随着肉桂醛和百里香酚浓度的继续增加，最终酒精产量却降低了，所以肉桂醛和百里香酚在低浓度可以促进酒精发酵提高酒精产量，但在高浓度时反而能抑制酒精发酵。

图2　肉桂醛和百里香酚对大米原料的生料发酵的影响Fig.2　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.4肉桂醛和百里香酚对玉米生料发酵的影响

取一定量的全磨玉米粉，以每个发酵三角瓶含100 g醪液计，加入33 g全磨玉米和67 g自来水，分别加入肉桂醛5，25和50 μg/L，百里香酚10，25，50和100 μg/L，用26%的浓H2SO4调节pH为4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴锅中培养，培养70 h后取样用HPLC测定发酵醪的组成和酒精含量。由图3可以看出，肉桂醛含量在5～50 μg/L时提高了最终酒精产量，在50 μg/L时酒精产量达到了14.30%vol，比对照(14.02%vol)提高了2.0%，百里香酚含量在10～25 μg/L时提高了最终酒精产量，在25 μg/L时酒精产量达到了14.22%vol，比对照提高了1.43%， 但是随着肉桂醛和百里香酚质量浓度的继续提高，最终酒精产量逐渐降低。

图3　肉桂醛和百里香酚对玉米原料的生料发酵的影响Fig.3　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on corn no-cooking process ethanol fermentation

综上所述, 在酒精生料发酵过程中分别添加肉桂醛或百里香酚或者添加二者的混合物，可以达到抑制杂菌的生长从而减少原料损失提高酒精产出的目的。考虑到肉桂醛和百里香酚在饲料中的作用，在酒精生料发酵过程添加这些物质提高了饲料的营养价值。

2.5肉桂醛和百里香酚对酵母细胞形态的影响

由于高浓度的肉桂醛和百里香酚在酒精生料发酵过程中能够抑制酵母生长从而导致酒精产量降低，本文针对肉桂醛和百里香酚对酵母细胞形态的影响进行了研究。取一定量的干酵母溶解于100 mL自来水中，分别加入100 μg/L的肉桂醛和230 μg/L的百里香酚作用4 h之后，在江南大学进行扫描式电子显微镜观测。由图4可以看出，经过高浓度的肉桂醛和百里香酚处理的酵母细胞壁出现了褶皱型的畸形，BENNIS[5]在研究百里香酚和丁子香酚对酵母细胞壁的影响中也曾经报道过这种现象，并且汪琨[6]等人在研究中发现，肉桂醛特异性抑制真菌细胞壁葡聚糖和几丁质的合成是其抑制真菌细胞生长的主要机制之一。

(a)对照；(b)100 μg/L肉桂醛作用4h；(c)230 μg/L百里香酚作用4h图4　肉桂醛和百里香酚对酵母细胞形态的影响Fig.4　Scanning electronic microscope of S. cerevisiae

3讨论

关于肉桂精油和百里香酚的抑菌作用机制的说法很多,赵丹[9]等人在研究中指出当肉桂精油作用于微生物菌体时,破坏了菌体的细胞膜结构,体内的一些重要离子(如K+和Na+)也随之流出，导致细胞内部的多种生物酶不能正常合成,从而阻碍了细胞的代谢活动。此外,胞内离子对维持细胞内外渗透压起到十分重要的作用,胞内离子流失则会影响内外渗透压的调节,破坏细胞内环境的稳定性。而戴向荣[10]等人在研究中则表明肉桂醛能通过损伤黄曲霉细胞质膜而进入细胞，使胞内大分子空间结构改变并且有序的新陈代谢被破坏，导致抑制黄曲霉的生长。这些都验证了肉桂精油通过先破坏菌体的表面结构,使其失去对周围物质的选择性,不能通透性地吸收和转运,当浓度达到一定程度时杀死了菌体,菌株生长则被完全抑制。

关于抑菌剂对酒精发酵的研究有很多，研究最多的就是乙酸和乳酸等抑菌剂对酒精发酵的影响[7]，如TARA GRAVES[8]在研究中就指出乙酸和乳酸在低浓度时能够提高酒精产量，减少酵母数量，但是随着浓度增加酒精产量也逐渐降低，这跟肉桂醛和百里香酚对生料酒精发酵的影响十分相似，酵母数量虽然减少，但是其发酵效率并不减弱，酵母数量过多反而生产效率降低，酵母数量减少，节省了产生RNA,DNA,蛋白质等的NADPH， 酵母可以有更多的能量去生产酒精，当然对于低浓度肉桂醛和百里香酚对酒精发酵的促进作用还需要进一步进行研究。

参考文献

[1]王年忠,赵二永,王芳,等，陈化小麦生料酒精发酵的中试[J].食品与发酵工业,2013,39(4):81-85

[2]段钢, 许宏贤, 孙长平,等.乙醇生产的技术进步—新型酶技术给乙醇生料发酵生产带来的突破[J] 食品与发酵工业,2006,32(7):65-70

[3]胡里奥.皮门特尔. 控制乙醇生产中的细菌生物膜[P].CN103930554A

[4]SKINNER K A,LEATHERS T D.Bacterial contaminants of fuel ethanol production[J].Ind Microbiol Biotech, 2004,31:401-408

[5]BENNIS S,CHAMI F,CHAMI N,et al.Surface alteration of Saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004,38(6): 454-458.

[6]汪琨, 徐峥, 汪倩雯,等.肉桂醛特异性抑制酵母细胞壁合成的作用机理[J].食品与发酵工业, 2012,38(3): 68-72.

[7]DEREK A,ABBOTT WM.Ingledew buffering capacity of whole corn mash alters concentrations of organicacids required to inhibit growth ofSaccharomycescerevisiaeand ethanolproduction[J] Biotechnology Letters,2004,26:1 313-1 316.

[8]TARA G,NEELAKANTAM V,NARENDRANATH K. Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol productivitybySaccharomycescerevisiaein corn mash[J] Ind Microbiol Biotechnol,2006,33: 469-474.

[9]赵丹,孙旸,陈光.肉桂精油抑菌作用的研究[J].长春:吉林农业大学学报,2013:1-3.

[10]戴向荣,蒋立科,罗曼.肉桂醛抑制黄曲霉机理初探[J].食品科学,2008,29(1):36-40

The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cookprocess ethanol fermentation

WANG Xin,XU Hong-xian,ZHOU Peng,DUAN Gang*

(Genercor (China) Bio-product Co. Ltd, Wuxi 214028, China)

ABSTRACTCinnamaldehyde and Thymol have anti-microbial activity, usually used as preservative in food processing and feed additive in poultry and piglet diets. The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cook process ethanol production was studied. The result showed that when using rice as raw material additional cinnamaldehyde at 10ppm orthymol at 50ppm resulted in 1.7% and 0.7% ethanol yield increasing respectively; similarwith rice, when using corn as raw material, 50 ppm cinnamaldehyde and 25ppm thymolresulted in 2.0% and 1.43% ethanol yield increasing respectively; However, if further increasing concentration of cinnamaldehyde and thymol,yeast growth was inhibited and ethanol yield was decreased.

Key wordscinnamaldehyde; thymol; no-cook process; ethanol

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606017

收稿日期：2016-01-27，改回日期：2016-03-15

第一作者：硕士(段钢博士为通讯作者，E-mail:gang.duan@dupont,com)。