肉牛宰后初期一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性在不同部位肉中的差异表达及与牛肉品质关系
2016-07-21张一敏朱立贤曹丽毛衍伟梁荣蓉牛乐宝韩明山罗欣
张一敏,朱立贤,曹丽,毛衍伟,梁荣蓉,牛乐宝,韩明山,罗欣*
1(山东农业大学 食品科学与工程学院,山东 泰安,271018) 2(内蒙古科尔沁牛业有限公司, 内蒙古 通辽,028000)
肉牛宰后初期一磷酸腺苷活化蛋白激酶活性在不同部位肉中的差异表达及与牛肉品质关系
张一敏1,朱立贤1,曹丽1,毛衍伟1,梁荣蓉1,牛乐宝1,韩明山2,罗欣1*
1(山东农业大学 食品科学与工程学院,山东 泰安,271018)2(内蒙古科尔沁牛业有限公司, 内蒙古 通辽,028000)
摘要文中主要探讨了一磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase,AMPK)在宰后早期(3、5.5、7和10 h)不同部位牛肉中的差异性表达以及对最终牛肉品质的影响。选取牛柳(psoas major, PM)与西冷(longissimus dorsi, LD)2个部位,分别测定pH值、AMPK活性、糖酵解指标和肉品质指标。研究结果表明:随着宰后时间的延长, AMPK的活性显著下降(P<0.05),而且PM中的AMPK活性显著高于LD(P<0.05); AMPK活性与pH值与肌糖原含量呈显著正相关,与乳酸含量及(AMP+IMP)/ATP[AMP:adenosine monophosphate,一磷酶腺苷;IMP:inosine monophosphate,肌苷酶;ATP:adehosine triphosphate,三磷酶腺苷)呈显著负相关关系(P<0.05),丙酮酸激酶随宰后时间先升高后降低(P<0.05),而且PM中丙酮酸激酶达到最大活性值的时间以及最大值要早于且高于LD(P<0.05);同时,PM在成熟期间表现出较高的嫩度以及较低的蒸煮损失(P<0.05)。上述结果表明,AMPK能够通过调节糖酵解进程而影响牛肉的品质。
关键词一磷酸腺苷活化蛋白激酶;牛肉;糖酵解;丙酮酸激酶;品质
一磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase,AMPK)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,被称为真核细胞的“代谢感受器”和调控细胞能量水平的“燃料开关”。该酶可以感知机体细胞能量代谢状态的改变,根据细胞的需能状况,通过影响物质代谢的多个环节,调节机体的产能和耗能代谢,维持细胞能量的供求平衡[1-4]。自1973年发现一磷酸腺苷(adehosine monophosphate,AMP)可以激活AMPK以来,对其研究从医学领域的抑制肿瘤[5-6]、介导胰岛素信号转导[7-8]及调节脂类营养代谢[8-9]等逐步深入至动物宰后生理生化进程及肉品科学研究领域,如AMPK诱导猪肉及禽肉产生PSE(pale,soft,exudative;灰白,柔软,汁液渗出)[10]及类PSE肉[11],调控肌内脂肪沉积[9],介导极限pH值[12]等方面。
肌肉转化为食肉需要经过一系列生理生化变化,能量代谢特别是糖酵解是这些变化过程的重要环节[13]。因此,能够调节宰后早期糖酵解进程并决定牛肉品质的AMPK无疑是一个有效的研究靶点。已有的研究表明,肌肉的收缩或缺氧条件能够提高AMP/ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)或AMP+IMP(inosine monophosphate,肌苷酸)/ATP(adenosine triphosphate,三磷酸腺苷)的比值从而导致AMPK的活化[14-15],而AMPK活化后能通过磷酸化糖酵解的关键酶介导糖酵解[14-16]。因此,AMPK活性与不同极限pH值牛肉的产生密切相关[9]。此外,研究发现环境因素的改变如高温,能够诱导过高的AMPK活性而使火鸡产生品质较差的类PSE肉[11],还有研究表明不同物种、不同功能组织如心脏、肝脏及肌肉AMPK的活性有所不同[17-18],但到目前为止对肉牛宰后初期AMPK活性与糖酵解关系的报导较少,不同部位牛肉在宰后初期这一品质形成的关键时期的AMPK活性的表达规律尚不明确。
本研究选择了牛柳(psoasmajor, PM)与西冷(longissimusdorsi, LD)2个部位肉作为研究对象,探讨不同部位牛肉中AMPK活性在宰后初期差异性表达及其与肉质之间的关系,初步揭示AMPK调节牛肉品质的机理。
1材料与方法
1.1材料
选用24月龄体重相近、性别相同的杂交牛6头(鲁西黄牛×西门塔尔,屠宰后胴体重(286.3±41.2) kg,屠宰方式为清真屠宰。在宰后3、5.5、7、10 h 分别从左侧胴体取PM和LD,分成小块,迅速置液氮中,再转入-80 ℃超低温冰箱保存。右半胴体在0~4 ℃排酸间成熟至宰后24 h后,取PM和LD,放置于0~4 ℃恒温箱至宰后14 d,进行剪切力和保水性指标的测定。
1.2仪器与设备
MP-120便携式pH计,瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;DM 6801A便携式数字温度计,深圳胜利高电子科技有限公司;UT-1901紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;LC-2030高效液相色谱仪,日本岛津公司;SpectraMax-M5酶标仪,美国MD公司;TA-XT2i质构仪,英国Stable Micro System公司;GL-20G-2冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;SPX-400智能型生化培养箱,宁波江南仪器厂。
1.3实验方法
1.3.1温度、pH值测定
在相应的取样时间点,使用便携式温度计和pH计测定两部位肉的中心温度与pH值,探头深度为2 cm,测定3次以上,取平均值。
1.3.2AMPK活性测定
参照ZHU等[11]的方法,采用免疫印迹手段,通过p-AMPK活性表征AMPK活性。取冷冻样品(100 mg)剔除肉眼可见的脂肪和结缔组织,在液氮中研磨,取40 mg样品粉末,加入混入1 mmol/L酶抑制剂的裂解液(50 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris),pH 7.4),150 mol/L NaCl,1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),1% 苯甲基磺酰氟) 400 μL,涡旋裂解(4 ℃),15 000 g离心5 min。取上清,采用BCA法测定蛋白含量,加入生理盐水定量至5 μg/μL。采用不连续SDS-PAGE电泳方法,根据蛋白质分子质量的不同进行蛋白分离。采用5% 浓缩胶,恒流10 mA;12%分离胶,恒流20 mA。将电泳后的凝胶置于转移缓冲液中(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸,15%甲醇),采用湿法将电泳凝胶中的蛋白转印到0.45 μm PVDF膜上。转印之前,PVDF膜先用甲醇润湿。转印条件为恒压60 V,2 h。转印后的PVDF膜用封闭液室温封闭2 h,用TTBS清洗,加一抗(anti phospho-AMPK-α (Thr 172)、AMPK-α-antibody、Anti-β-Actin Antibody),抗体按照产品要求进行稀释,在4 ℃培养箱,于摇床上缓慢摇动孵育过夜。孵育结束,在TTBS中浸洗3次,每次15 min,加入二抗(HRP-labeled goat anti-rabbit IgG)室温孵育反应2 h,孵育结束后用TTBS 浸洗3次,每次15 min。采用ECL方法进行荧光显影,将A液与B液按照体积比1∶1进行混合,使其均匀地分布在膜转印蛋白附着面,于发光成像仪中进行拍照显影。
1.3.3糖原和乳酸含量测定
糖原和乳酸含量采用试剂盒(南京建成)进行测定,试验具体操作和结果计算参照各试剂盒的说明进行。测定波长分别为620 nm和530 nm。
1.3.4ATP、ADP(adenosine diphosphate,二磷酸腺苷)、AMP、IMP的含量测定
参照VECIANANOGUES等[19]的方法采用高效液相色谱仪测定ATP、ADP、AMP和IMP的含量。取冷冻肌肉(已剔除可见脂肪和结缔组织),加入3倍体积的冷却0.9 mol/L的HClO4,在冰浴中提取30 min,然后在4℃冷冻离心机中13 000 g离心10 min。上清液用2 mol/L的NaOH 溶液中和至pH值中性,然后在同等条件下离心去除多余的高氯酸,并且用0.2 μm的滤膜过滤。取10μL的肌肉提取液用进样针注入到Diamonsil C18色谱柱中(4.6 mm×250 mm,5μm)。流动相A为磷酸盐缓冲溶液(0.04 mol/L KH2PO4和0.06 mol/L K2HPO4,pH 7.0),流动相B为乙腈,流速为1.0 mL/min。洗脱程序参照SHEN等[15]的方法,具体为0 min,100%A和0%B;8min,95%A和5%B;20 min,75%A和25%B;26 min,70%A和30%B;30 min,100%A和0%B。检测器波长为254 nm,ATP、ADP、AMP和IMP的含量通过外标的保留时间和峰 面积来进行计算。
1.3.5丙酮酸激酶含量测定
丙酮酸激酶含量采用试剂盒(南京建成)进行测定,试验具体操作和结果计算参照各试剂盒的说明进行。测定波长分别为340 nm。
1.3.6剪切力测定
参考LUO等[20]的方法测定牛肉的剪切力。在宰后1、3、7、14 d打开包装袋取出肉块,80 ℃水浴到肉块中心温度70℃,室温冷却后在放入0~4 ℃冰箱内过夜。用直径为1.27 cm的空心取样器沿肌纤维方向取肉柱(注意避开筋键),采用TA-XT2i型质构分析仪的HDP/BSW探头测定肉柱的剪切力值,并通过Texture Expert V 1.0软件分析。测定时各控制参数为:测前速 2.0 mm/s,测中速 1.0 mm/s,测后速 10.0 mm/s,下压距离23.0 mm,负载类型 Auto-40 g。每个肉块测定6次以上,各肉柱剪切力值的平均值为肉块的剪切力值。
1.3.7蒸煮损失测定
在宰后1、3、7、14 d打开包装袋取出肉块,用滤纸吸干肉块表面汁液,称重(m1)后,然后重新装袋封口,在80 ℃水浴中加热至肉块中心温度达到70 ℃,维持20 min,将袋中蒸煮产生的汁液倒出,冷却至室温,然后放于0~4 ℃过夜,用滤纸吸干肉块表面汁液,称量(m2);蒸煮损失率的计算公式为。
(1)
1.3.8数据统计与分析
采用gel-pro analysis 6.0图谱分析软件进行蛋白免疫印迹图谱分析,采用Simaplot 12.0软件进行作图。应用SSPS 18.0进行数据分析,采用LSD等方法进行方差分析,差异显著水平α为0.05。每个试验重复3次,结果表示为(平均数±标准差)。
2结果与讨论
2.1温度与pH值的变化
图1 宰后初期牛柳(PM)与西冷(LD)的温度与pH值变化Fig.1 The temperature and pH values of PM and LD during early post-mortem time
如图1所示,PM和LD温度降低的速率无显著差异(见图1-a)。而二者的pH值在宰后3~10 h差异较显著(P<0.05)(见图1-b),宰后3h PM的pH值已降至6.0左右,显著低于LD(pH 6.5)。随着宰后时间的延长两部位肉的pH值逐渐降低,至宰后10 h,两部位肉的pH值已接近牛肉的极限pH值。不同部位肉因肌纤维类型及糖原含量等的不同,初始pH值及pH值下降速率有一定差异。KIM等[21]也发现,PM的初始pH值低于LD,且PM的pH值下降速率较大。宰后初期肌肉的温度和pH值,对于后续的糖酵解进程以及最终形成的肉的品质具有重要影响。
2.2AMPK活性
以p-AMPK(α)苏氨酸172位点(Thr 172)的磷酸化所表征的AMPK活性如图2所示。两部位肉的AMPK活性随宰后时间的延长逐渐降低,且宰后10 h内PM中AMPK的活性均显著高于LD(P<0.05)。宰后3 h两部位肉中AMPK活性差异最大,PM中该酶的活性约为LD的3倍,宰后10 h PM中AMPK活性由最初的0.60降为0.30,而LD中该酶的活性一直保持较低水平。对PM中AMPK活性与后续糖代谢指标进行相关性分析得出,AMPK活性与糖原含量、乳酸含量及AMP/ATP均显著相关(P<0.05),这与活体小鼠[23-24]、火鸡肉[11]、猪肉[28]中AMPK活性与糖代谢关系研究结果相一致。
图2 宰后早期牛柳(PM)与西冷(LD)的AMPK活性Fig.2 The AMPK activity of PM and LD during early post-mortem time by western blotting
2.3能量代谢相关指标
宰后初期两部位肉的糖原含量、乳酸含量及AMP、IMP、ATP含量如图3和表1所示。总体来看,糖原在两部位肉中的含量随宰后时间的延长呈降低趋势,且PM中糖原含量显著低于LD中的含量(P<0.05)(图3-a)。宰后3 h时PM中糖原含量为3.11 mg/g,而LD中的含量为5.87 mg/g,宰后5.5 h两部位肉中糖原的含量均发生显著降低,而之后一直到宰后10 h糖原的含量几乎未发生显著变化。
乳酸因宰后牛体血液循环的停止无法排出体外,因此随糖酵解的进行逐渐累积。宰后3~10 h,两部位肉的乳酸含量差异显著,但是随宰后时间的延长两部位中乳酸的增加量不显著,宰后3 h时PM中含量为117μmol/g,至10 h仅增至124 μmol/g,LD中乳酸的含量因糖原消耗量较大其增幅高于PM,由89 μmol/g增到116 μmol/g。PM中持续较高的乳酸含量导致其较低的pH值。
图3 宰后早期牛柳(PM)与西冷(LD)的能量代谢相关指标的变化Fig.3 Glycogen, lactate and ratio of AMP+IMP and ATP of PM and LD during early postmortem time
ATP在肌肉中的含量较少,当肌肉由有氧呼吸转为无氧酵解时,其生成量进一步减少。当ATP耗尽时,ADP会进一步释放能量,产生AMP及IMP。因此AMP和IMP会逐渐累积,AMP+IMP与ATP的比值表征了ATP的消耗速率。由表1可知,两部位肉的ATP含量差异显著,宰后3~10 h,PM中ATP的含量一直保持在较低水平(0.2 μmol/g),显著低于LD,而(AMP+IMP)/ATP的数值显著较高。肌肉的糖酵解进程在宰后前几个小时反应较为剧烈,糖原消耗较快。本研究中PM的初始能量水平(ATP含量)显著低于LD,其能量缓冲能力较差,糖酵解在前3 h可能已经进行。
2.4丙酮酸激酶活性
AMPK能感知机体细胞能量代谢状态的改变,ATP浓度下降,AMP浓度上升时,即AMP/ATP比值提高时,AMPK可被激活[15, 26-27],AMPK一旦被激活,可以磷酸化下游底物,如果糖磷酸激酶和丙酮酸激酶等,加速宰后糖酵解。因此本研究对相应的丙酮酸激酶的活性进行了测定,结果如图4所示。宰后3~10 h,丙酮酸激酶在两部位肉中的活性呈现先升高后降低的趋势,第5.5 h PM中该酶的活性达到最高为5 880个酶活单位,显著高于LD中的活性,之后随着宰后时间的延长活性逐渐降低,第7 h与10 h两部位肉中该酶的活性无显著差异。丙酮酸激酶作为糖酵解途径的3个限速酶之一,其活性的提高能够提高糖酵解速率。有研究发现在高温环境下鸡肉中AMPK可能会诱导丙酮酸激酶的磷酸化,加速宰后糖酵解,导致pH值降低过快,产生PSE肉[11]。SHEN等人以小白鼠为研究对象发现,通过敲除AMPK基因和注射AMPK抑制剂,均能够显著降低丙酮酸激酶的活性[24]。本研究中AMPK活性较高的PM中丙酮酸激酶达到最大活性的时间早于LD,说明在牛肉中AMPK能够介导丙酮酸激酶的活性而调节糖酵解进程。
表1 宰后早期西冷(LD)与里脊(PM)中ATP,
ATP: 三磷酸腺苷; AMP: 磷酸腺苷; IMP: 肌苷酸
*不同部位肉在同一宰后时间点差异显著(P< 0.05)。
图4 宰后早期牛柳(PM)与西冷(LD)的丙酮酸激酶活性Fig.4 Thepyrugvate kinase activity of PM and LD during early post-mortem time
2.5成熟期间嫩度及保水性
嫩度和保水性是评价牛肉品质最关键的指标,较低的剪切力表示较好的嫩度,较少的蒸煮损失在一定程度上表征肉的保水性较好。目前牛肉嫩度的测定,一般采用质构仪测定直径为1.27 cm肉柱所用的力(WBSFV-Warner-Bratzler shear force value)来表示,肉样一般经过水浴加热至中心温度达70 ℃,与消费者食用熟制肉的主观评价相对应[20-21]。该方法已在肉品科学研究领域得到广泛应用,也是我国最新农业部行业标准NY/T 2793-2015规定的牛肉剪切力的测定方法[22]。如表2所示,与LD相比较,PM的嫩度在牛肉成熟期间均显著较高(P<0.05),而蒸煮损失则显著较低(P<0.05)。这一结果与KIM等人的研究结果一致,PM为牛体上品质最好的部位肉,具有较好的嫩度,较好的保水性和多汁性[21]。
表2 宰后不同成熟时间不同部位肉的剪切力值与蒸煮损失
不同部位肉由于肌纤维组成、结缔组织含量及宰后糖酵解速率和程度的不同,形成的肉的品质不同。PM与LD的肌纤维组成仅有略微差异,因此宰后糖酵解速率对两部位肉品质的形成具有关键作用。PM在宰后初期具有较高的糖酵解速率,pH值降低速率较快,糖原含量及ATP在宰后一段时间均处于较低水平,且丙酮酸激酶较早达到最高活性,与PM具有较高的AMPK活性相互对应。ZHU等发现,过高的AMPK活性能够加快糖酵解速率的进行而影响火鸡的肉质[11]。关于不同部位肉中AMPK活性的研究较少,目前仅有李泽等研究发现羊肉的股二头肌与颈肉中AMPK 的酶活大于背最长肌与腹肉的活性,所对应的剪切力值显示腹肉大于其他3个部位肉[28],但是由于该研究未采用免疫印迹的方法测定AMPK活性,且研究对象为羊肉,因此与本研究的结果表现出不一致性。AMPK活性与肉品质之间的关系还需要通过AMPK抑制剂或激活剂的介导来进一步确定[23-24]。
3结论
宰后初期牛肉中糖酵解速率受到AMPK 活性大小的影响。与LD相比,由于PM中AMPK含量相对较高,导致其具有较高的糖酵解速率,而且PM中丙酮酸激酶的活性较早达到最大活性,说明AMPK可能通过介导丙酮酸激酶加快糖酵解进程。另外,PM在成熟期间表现出较高的嫩度以及较低的蒸煮损失,说明AMPK的活性在不同部位肉中表现出的差异性对牛肉的品质产生一定影响。通过调节AMPK的活性来实现其对牛肉品质的调控是下一步研究的主要目标。
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The differential expression of AMPK in different beef muscles during early-postmortem
ZHANG Yi-min1, ZHU Li-xian1, CAO Li1, MAO Yan-wei1,LIANG Rong-rong1, NIU Le-bao1, HAN Ming-shan2, LUO Xin1*
1(Shandong Agricultural University, College of Food Science and Engineering, Tai’an 271008,China)2(Inner Mongolia khorchin industry co., LTD. Inner Mongolia, Tongliao 028000,China)
ABSTRACTThe objective of this study was to evaluate the activities of AMP-activated proteinkinase (AMPK) in different beef cattle muscles during early- postmortem time (3h, 5.5h, 7h and 10h). Beef samples from psoas major (PM) and longissimus dorsi (LD) parts were used in the study and their pH value, AMPK activity, glycolysis characters were tested. Results showed that AMPK activity was higher (P<0.05) in PM than that in LD, and this proteinkinas activity decreased (P<0.05) with the increase of postmortem time. The correlation analysis indicated that activation of AMPK was positively related to pH value and glycogen content, negatively related to lactate content, and negatively related with the ratio of AMP+IMP to ATP. The pyruvate kinase activity reached the highest activity value was earlier in PM than that of in LD. Furthermore, compared with LD, the tenderness in PM was better and cooking loss was lower (P<0.05). Those results indicated that the activity of AMPK has a potential effect on beef quality through regulating the glycolysis pathway.
Key wordsAMP-activated proteinkinase; beef; glcolysis; pyruvate kinase; beef quality
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606013
基金项目:国家自然科学基金项目(No.31271901); 农业部产业技术体系(No. CARS-38); 山东省现代农业产业技术体系 (No. SDAIT-09-09)资助
收稿日期:2015-09-29,改回日期:2015-12-01
第一作者:博士,讲师(罗欣教授为通讯作者,E-mail:luoxin@sdau.edu.cn)。