具有典型泛醌结构成分微生物参比菌株的筛选

苏姣姣,翟磊,张露,姚粟,程池

(中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)



具有典型泛醌结构成分微生物参比菌株的筛选

苏姣姣,翟磊,张露,姚粟,程池

(中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)

摘要泛醌(Ubiquinone，UQ)是一种类异戊二烯醌，是微生物分类鉴定的主要化学分析指标之一。采用薄层层析与高效液相色谱相结合的方法对具有典型泛醌组分的微生物菌株进行测定、分析，通过比较菌株的生长性能以及泛醌类型与含量，最终得到培养条件简单、培养时间短且泛醌成分单一、含量高的一套参比菌株。该套菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CICC 31691，东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)CICC 1817，眼马赛菌(Massilia oculi)CICC 23887，日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)CICC 23895，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)CICC 10287分别为Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10醌组分的参比菌株，可应用于细菌和酵母的常规鉴定及新种分类鉴定。

关键词泛醌；菌株筛选；参比菌株

泛醌(辅酶Q)是一类参与微生物呼吸链电子传递和氧化磷酸化的重要辅酶，普遍存在于各种生物膜上，如原核生物质膜[1]和真核生物的线粒体内膜[2]。目前关于泛醌的生物合成[3-4]、生理功能及代谢途径[5-6]研究均较为深入，由于合成结构的特殊性(类异戊二烯醌，其类异戊二烯侧链长度及链上氢饱和度具有差异性)，泛醌成为了微生物化学分类的主要化学分析指标之一。分析泛醌组分的构成便于帮助我们了解微生物的多样性[7]，并且对于确定新种分类地位也非常重要[8]。

高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法是测定类异戊二烯醌组分的常用方法之一，可通过与标准品或从标准菌株中提取的醌样品进行比较分析，鉴定不同类型的醌。由于醌化学性质不稳定[9]，醌标准品价格昂贵、种类不足，筛选一组涵盖不同醌组分的参比菌株作为醌成分分析的参照，可一定程度上解决该问题。与醌标准品相比，参比菌株的选择还具有很多明显的优势。首先菌株易保存，相比于醌的保存需要避强光、强碱、氧气及水等，菌株的保藏条件要比醌宽泛。其次菌株易扩繁，醌物质本身不具有再生性，而菌株可以通过传代培养重复获得菌体，极好地体现了菌株使用的经济性。再次，醌标准品可提供醌类型、醌含量的参照，但参比菌株可与实验菌株同时进行醌的提取、测定、分析，作为整个试验过程的参照。此外，该组参比菌株的选择还具有灵活性，可根据试验需要选择所需相应醌型的一株或多株菌株，将从中提取到的醌单独或混合使用作为参照。

本试验以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)[10]，《The yeasts: a taxonomic study》(第五版)[2]以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)[11]更新的菌株信息为主要参考依据，首先确定Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五种待选泛醌类型，再根据上述醌型分别选择对应的1～3株供试菌株。以前期建立的HPLC分析方法以及基于该方法确定的醌组分保留时间为依据，结合菌株的生长状况对具有相同醌型菌株进行比较，从中筛选单一泛醌组分含量较高，易培养，易提取的菌株，构成一套泛醌参比菌株，用于微生物常规鉴定及新种分类鉴定。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1培养基

培养基：麦芽浸粉肉汤(Malt Extract Broth，MEB)、营养肉汤(Nutrient Broth，NB)和胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase Soy Broth，TSB)，均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.2主要试剂和仪器

试剂：三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲苯和正己烷均为分析纯，购自北京化工厂。NaOH、焦性没食子酸，均购自西陇化工股份有限公司。液相分析用甲醇和异丙醇，均为色谱纯，分别购自美国Fisher Scientific公司和美国J.T.Baker公司。

仪器设备：培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；离心机，Eppendorf；-80 ℃冰箱，Thermo Fisher Scientific；恒温水浴锅，国华电器有限公司；旋转蒸发仪，IKA；真空冷冻浓缩仪，LABCONCO；三用紫外分析仪，上海精科实业有限公司；TLC硅胶薄层板GF254，Merck；层析缸；高效液相色谱仪，SHIMADZU。

1.2供试菌株的选择

以Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五种醌组分为选择依据，各挑选1～3株以上述组分为唯一或主要醌型，且来源方式简单，生长温度适度，菌体富集时间短的菌株。所有供试菌株均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)提供。

1.3菌体的培养与收集

将供试菌株分别接种于相应的液体培养基中，在各自的培养温度下，采用200 r /min转速摇瓶培养24 h。检查无污染后，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，将湿菌体于-20 ℃预冻1 h，-80 ℃预冻1 h，真空冷冻干燥18 h。冻干菌体置于干燥器中备用。

1.4醌的提取

细菌醌的提取：将冻干菌体转入装有30 mL三氯甲烷∶甲醇(2∶1，V/V)的离心管中，添加少量玻璃珠，于黑暗处摇瓶过夜10 h。用滤纸过滤收集滤液于干净、干燥的100 mL旋蒸瓶中，于37 ℃减压蒸馏至干燥。

酵母泛醌的提取[12]：将冻干菌体转入150 mL水∶甲醇(1∶2，V/V)的混合物中，添加20 g NaOH和5 g焦性没食子酸。95 ℃，40 min水浴加热后，自来水冷却25 min。加入80 mL的正己烷，剧烈振摇，6 000 r/min，离心3 min，收集正己烷提取液层于另一干净容器中。余下溶液加入正己烷重复2次，将3次的正己烷提取液收集到一起。为了消除碱性加入30 mL蒸馏水，振摇，收集正己烷层转入旋蒸瓶，37 ℃减压蒸馏至干燥。

分别用适量(约5 mL)丙酮重新溶解干燥物，12 000 r/min离心3 min，再采用真空冷冻浓缩仪将其浓缩至40 μL左右，得到醌的粗提样品。

1.5醌的纯化

1.5.1薄层层析(TLC)

准备工作：倒入适量展层剂甲苯于层析缸(20 cm×10 cm×10 cm)中，盖上盖子，放置1 h，使缸内甲苯气体达到饱和状态。硅胶薄层板GF254(10 cm×5 cm)于65 ℃活化30 min。点样与层析：将醌的粗提样品，长条状点样于GF254硅胶板上。吹干后将硅胶板置于层析缸中层析，距顶边1 cm时取板，风干。

1.5.2紫外观察

将硅胶板置于254 nm紫外灯下观察。绿色荧光背景下，比移值Rf为0.3～0.5的位置有暗褐色的条带则为泛醌组分。

1.5.3纯化醌样品

将醌组分条带刮下，收集硅胶粉，用1 mL丙酮溶解后采用疏水性注射过滤器过滤，使用真空冷冻浓缩仪将滤液浓缩至干燥，置于-20 ℃黑暗处保存备用。

1.6供试菌株泛醌组分分析及含量比较

采用HPLC对得到的醌纯化样品进行组分分析。分析条件如下：仪器为岛津高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.)，流动相为V(甲醇)∶V(异丙醇)=2∶1，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，检测器为光电二极管阵列检测器(PDA)，泛醌用检测波长为273 nm。HPLC上样前用200 μL丙酮(总样量)重新溶解醌纯化样品，12 000 r/min离心3 min，取上清液转移至HPLC专用样品瓶中，进样量为20 μL。

HPLC定量分析泛醌组分，通常采用外标法,根据峰面积来定量[13]。因为本试验为定性分析试验，所以将相对峰面积值作为指标，比较不同菌株间醌组分含量。具体是将每1 mg干菌体所对应醌组分的峰面积值进行比较，按公式(1)计算：

(1)

式中：峰面积单位，AU × min；进样体积，μL；总样体积，μL；干重，g。

2结果与分析

2.1供试菌株选择

细菌或酵母的类异戊二烯醌成分可能为多种醌的混合物，然而通常只有一种为主要成分[14]。以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《The yeasts : a taxonomic study》为主要参考依据进行检索，在属水平上，统计以泛醌为主要或唯一醌型的菌株数量，结果如图1所示。细菌涉及的泛醌类型主要有Q-8、Q-9、Q-10三种，且主要分布于变形菌门(Proteobacteria)的α，β，γ-变形菌纲，其中α-变形菌纲以Q-10为主，β-变形菌纲以Q-8为主，γ-变形菌纲多数以Q-8，少数以Q-9为主。酵母中涉及的泛醌类型较多，包括Q-5、Q-6、Q-7、Q-8、Q-9、Q-10和Q-10 (H2)。其中，以Q-9为主要醌型的菌株最多，其次是Q-10，其他如Q-6、Q-8 和Q-7水平较相近，而Q-5和Q-10 (H2)涉及的属最少。

图1　泛醌分布情况Fig. 1　Distribution of ubiquinones

整体来看，细菌和酵母中主要的泛醌类型包括Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五种，细菌的参比菌株只能提供Q-8、Q-9和Q-10三种醌型，因此Q-6、Q-7醌型的参比菌株从酵母菌中选择。所有供试菌株选自属水平上以某种泛醌为主要醌型的菌株： Q-8醌型菌株自嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和马赛菌属(Massilia)中选择，Q-9醌型菌株自假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和盐单胞菌属(Halomonas)中选择，Q-10醌型菌株自亚细亚菌属(Asaia)、红细菌属(Rhodobacter)和螯台球菌属(Chelatococcus)中选择，Q-6醌型菌株自有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)中选择，Q-7醌型菌株自伊萨酵母属(Issatchenkia)选择。

再对所选菌株的培养条件(培养基、培养温度、需氧性)以及培养时间进行初步筛选，从中选择所需培养基成分简单、不嗜热或不嗜冷、好氧生长的菌株。菌株信息及培养条件见表1。所有菌株均是由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的出具菌种证明(Certificate of Analysis，COA)的菌株。

2.2供试菌株泛醌组分分析及含量比较

2.2.1供试菌株泛醌组分分析

采用HPLC法对上述11株菌的醌组分进行测定，并根据前期对该HPLC分析条件下保留时间的研究(表2)，进行醌成分判定。

表1　供试菌株信息

表2　Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10的保留时间

HPLC分析结果(表3)显示，CICC 1631和CICC 31691均只有1个吸收峰，保留时间分别为8.542和8.546 min，由表2可判定该唯一泛醌组分为Q-6。CICC 1817只有1个吸收峰，其保留时间为9.552 min，由表2可判定该唯一泛醌组分为Q-7。CICC 23896和CICC 23887均只有1个吸收峰，保留时间分别为13.013和12.988 min，由表2可判定该唯一泛醌组分为Q-8。CICC 23895 和CICC 23885均只有1个吸收峰，其保留时间分别为18.167和18.185 min，由表2可判定该唯一泛醌组分为Q-9。CICC 23878具有2个吸收峰，主成分(75.06%)的保留时间为18.191 min，次要成分(24.94%)的保留时间为13.041 min，由表2可判定该菌以Q-9作为主要醌组分，Q-8作为次要醌组分。CICC 23879、CICC 10287和CICC 10545均只有1个吸收峰，保留时间分别为25.716、25.703和25.641 min，由表2可判定该唯一泛醌组分为Q-10。

2.2.2供试菌株泛醌主成分含量比较

根据1.6所述方法，比较供试菌株间同种醌组分的相对峰面积值(图2)。可以看出，CICC 31691与CICC 1631相比，前者Q-6含量略高于后者。CICC 1817(Q-7)没有与之醌型相同的菌株，但是该菌的相对醌含量与其他供试菌株相比处于中等水平。CICC 23887与CICC 23896与相比，前者Q-8的相对含量是后者的2.4倍。CICC 23878、CICC 23895和CICC 23885相比，CICC 23878中Q-9的相对含量最高；将另2株具有单一泛醌组分的CICC 23895与CICC 23885相比可发现，前者含量较高。CICC 23879、CICC 10287和CICC 10545相比，CICC 10287中Q-10的相对含量要远高于其他2株菌。

表3　供试菌株泛醌组分保留时间

图2　菌株泛醌含量比较Fig.2　Comparison of the content of ubiquinones

2.3参比菌株的确定

试验过程中，所有菌株在其相应培养条件下，均能快速生长，培养时间均不超过24 h。所有在生长性能方面菌株间无明显差异。因此根据醌组分含量分析结果，寻找相对含量较高的、具有单一泛醌组分的参比菌株，Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10每种醌型分别对应确定一株参比菌株(表4)，其中Q-6醌型菌株为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)CICC 31691，Q-7醌型菌株为东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)CICC 1817，Q-8醌型菌株为眼马赛菌(Massiliaoculi)CICC 23887，Q-9醌型菌株为日本假单胞菌(Pseudomonasjaponica)CICC 23895，Q-10醌型菌株为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)CICC 10287。

表4　参比菌株信息

3讨论

泛醌具有重要的分类意义，其类异戊二烯醌侧链长度及氢饱和度差异的情况，可以反映细菌或酵母的系统发育关系，并作为描述分类单位特征以及与其他分类单位关系的参考指标。目前采用HPLC分析测定泛醌组分，需要以标准品或可靠菌株中提取到的醌样品作为对照。由于标准品的价格昂贵、种类不足，以标准菌株作为参照[24]成为研究者的首选方法。参比菌株能作为试验全程的参照，并且易保存、易扩繁，作为标准品的替代可极大地节省试验成本。但现在对于参比菌株的选择多局限于某一种醌型，缺乏一套整体性的涉及较多醌型的参比菌株。因此本研究经大量文献筛选与供试菌株筛选试验，最终确定一套培养条件简单、培养时间短且泛醌(Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10)成分单一、含量较高的参比菌株。

由于细菌中涵盖的主要泛醌种类只有Q-8、Q-9和Q-10三种，因此Q-6和Q-7醌型的菌株自酵母中选择。该套参比菌株全部由国家微生物资源平台工业子平台中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供，具有单一醌型及明确的分类地位，可应用于酵母或细菌的常规鉴定及新种的分类鉴定。包括某些同属菌株的区分，如在假丝酵母属(Candida)有醌型记载的155种菌中，以Q-9、Q-7、Q-8和Q-6为唯一醌型的菌株分别占总菌种数的63%、23%、12%和2%，由于这种差异的存在，泛醌可以作为有利的分析项；也可应用于某些不同属菌株的区分，如水螺菌属(Aquaspirillum)菌株，泛醌类型主要分为两类，一类为Q-8，另一类则为Q-9和Q-10；还可应用于不同属但系统发育关系相近菌株的区分，如醋杆菌属(Acetobacter)与葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)，二者分别以Q-9和Q-10为主要醌型。此外该套参比菌株中的部分菌株除了作为醌分析的参照，还具有很高的食品、发酵应用价值。如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)为可食用菌种，可作为奶啤、乳清饮料等产品发酵生产的重要菌种[25]。东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)在木质纤维素水解产物发酵方面具有很好地应用[26]。类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)目前已经成为工业化大规模生产Q-10的重要菌株[27]。

本试验中除了所筛选的单一醌型菌株外，也存在AcinetobacterindicusCICC 23878 这种含2种醌组分，且次要组分比例较高(>20%)，整体醌含量水平也较高的菌株，可以考虑将其作为混合醌型参比菌株来使用。类异戊二烯醌种类繁多，除泛醌外，还有甲基萘醌、脱甲基甲基萘醌(Demethylmenaquinone)等一系列较常见的醌类型。所以，增加参比菌株醌型范围，提高参比菌株的丰富性对于微生物分类鉴定具有更广阔的适用性。

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Screening of reference microorganisms strains with typical ubiquinones components

SU Jiao-jiao,ZHAI Lei,ZHANG Lu,YAO Su,CHENG Chi

(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 10015,China)

ABSTRACTUbiquinone (UQ) was a kind of isoprenoid quinones and served as one of the key indexes for microorganism taxonomy and identification. The strains with typical UQ components were measured and analyzed by thin-layer chromatography combined with high performance liquid chromatography (HPLC). A group of reference strains with the characteristics of simple culture condition, uniform composition and high content of UQ were confirmed by comparing growth performance, UQ types and contents of microorganism strains. Those reference strains included Kluyveromyces marxianus CICC 31691, Issatchenkia orientalis CICC 1817, Massilia oculi CICC 23887, Pseudomonas japonica CICC 23895, Rhodobacter sphaeroides CICC 10287, and were used as a reference for Q-6, Q-7, Q-8, Q-9 and Q-10, respectively. Owing to the accuracy of UQ types and the legitimacy of taxonomic status, these strains were used as reference strains for the identification of strains with unknown quinones.Ubiquinone (UQ) was kind of isoprenoid quinones and served as one of the key indexs for microorganism taxonomy and identification. The strains with typical UQ components were measured and analyzed by thin-layer chromatography combined with high performance liquid chromatography (HPLC). Agroup of reference strains with the characteristics of simple culture condition, uniform composition and high content of UQ were confirmed by comparing growth performance, UQ types and contents of microorganism strains. Those reference strains included Kluyveromyces marxianus CICC 31691, Issatchenkia orientalis CICC 1817, Massilia oculi CICC 23887, Pseudomonas japonica CICC 23895, Rhodobacter sphaeroides CICC 10287, and used as a reference for Q-6, Q-7, Q-8, Q-9 and Q-10, respectively. Owing to the accuracy of UQ types and the legitimacy of taxonomic status, these strains were adapted for the identification of strains with unknown quinones as reference strains.

Key wordsubiquinones;strains screening;reference strains

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606009

收稿日期：2015-12-25，改回日期：2016-02-22

第一作者：硕士研究生(程池教授级高级工程师为通讯作者，E-mail：cheng100027@163.com)。