来源于胞曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶在酿酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中的定位表达

董宁远，张阁元，徐沙，高晓冬

(江南大学 生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)



来源于胞曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶在酿酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中的定位表达

董宁远，张阁元，徐沙，高晓冬*

(江南大学 生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

摘要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产医药糖蛋白，必须对其N-糖基化途径进行人源化改造。在敲除酿酒酵母W303A特异性糖基化基因ALG3、OCH1和MNN1后，表达来源于胞曲霉(Aspergillus saitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)进一步改造酿酒酵母N-糖链。通过在MsdSp的C-端添加内质网滞留信号(HDEL)和构建高尔基体滞留信号Kre2p与MsdSp的嵌合体蛋白实现MsdSp在内质网和高尔基体中的定位表达。结果表明，各突变株中均检测到Man3GlcNAc2和Man4GlcNAc2型N-糖链，并且在强启动子酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)控制下，内质网定位表达MsdSp的菌株KM201中，Man3GlcNAc2和Man4GlcNAc2型N-糖链含量较多。该研究为酿酒酵母N-聚糖进一步人源化改造提供依据。

关键词酿酒酵母；人源化；N-糖链结构；细胞定位

N-糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式[1]，糖链对蛋白质的生物活性、稳定性，分子间的相互识别，特定的免疫反应以及糖蛋白药物的半衰期等方面都有重要的影响[2-3]。目前已有多种糖蛋白药物被批准用于治疗人类疾病[4]。迄今为止，生产医药糖蛋白的主要途径是哺乳动物细胞培养(如中国仓鼠卵巢细胞系CHO、人类胚胎肾细胞HEK等)。哺乳动物细胞株的优势在于其重组蛋白的糖基化形式为复合型、杂合型，与人类相似。但是，基因操作复杂、外源基因不能精确定位、生产成本高等问题限制了哺乳动物表达体系的应用和发展[5]。近年来，研究人员开始尝试在酵母等微生物中表达医药糖蛋白。

酿酒酵母和高等哺乳动物细胞内质网中的N-糖基化过程具有高度保守性[6-7]。二者均是先组装一个多萜醇寡糖前体(Dol-PP-Glc3Man9GlcNAc2)，然后在寡糖基转移酶(OST)的催化下，将糖链从前体上转移至新生肽链的天冬酰胺(Asn)残基上(N-糖基化位点序列Asn-X-Ser/Thr)。随后，N-糖链被葡萄糖苷酶(Glucosidase)和α-1,2-甘露糖苷酶(α-1,2-mannosidase，MnsI)特异性识别，切去3个葡萄糖和1个甘露糖形成Man8GlcNAc2型N-糖链。进入高尔基体后，酿酒酵母和高等哺乳动物细胞的N-糖基化出现差异。在哺乳动物细胞高尔基体中一系列甘露糖苷酶的作用下，切去5个甘露糖，形成Man3GlcNAc2糖链，再依次在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)、半乳糖基转移酶(GalT)及唾液酸转移酶(SiaT)的作用下，添加若干N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸，形成复合型或杂合型N-糖链[8]。然而，在酿酒酵母高尔基体中，Man8GlcNAc2首先被α-1,6-甘露糖基转移酶(Och1p)特异性识别，添加一个甘露糖。然后，在一系列糖基转移酶的作用下，继续添加几十至几百个甘露糖，形成高甘露糖型N-糖链[9-10]。因此，未经改造的酵母生产的糖蛋白具有高甘露糖型糖基化修饰，不仅会影响蛋白质的活性及反应动力学性质还会引起人体的过敏反应, 因此必须对酵母糖基化途径进行人源化改造[11]。早在1993年，NAKANISHI-SHINDO[12]等发现通过同时敲除酿酒酵母的OCH1和MNN1基因，可以消除酿酒酵母高甘露糖型N-糖基化。CHIBA[13]等同时敲除了酿酒酵母的OCH1、MNN1及MNN4基因，并成功表达了来源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶，首次在酿酒酵母中得到了人类N-糖基化中间体Man5GlcNAc2。2004年，DAVIDSON等[14]通过敲除毕赤酵母的ALG3、OCH1基因，阻止了α-1,3-和α-1,6-甘露糖残基连接到Man5GlcNAc2糖链上，并通过α-1,2-甘露糖苷酶的体外酶切处理得到了人源化过程的核心型糖链结构Man3GlcNAc2。

本实验以酿酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1为出发菌株，通过在菌株中定位表达来源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)进一步人源化酿酒酵母的N-聚糖。利用内质网滞留信号HDEL或高尔基体滞留信号Kre2p实现蛋白在内质网或高尔基体中的定位表达。MALDI-TOF-MS分析结果表明重组菌中均出现了Man4GlcNAc2和Man3GlcNAc2型N-糖链，并且内质网定位表达MsdSp的作用效果优于高尔基体定位。此外，在酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)的调控下，重组菌中Man3GlcNAc2型N-糖链含量有了显著提高。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

本实验用到菌株的名称及特征见表1。质粒pUC57-MsdS由南京金斯瑞生物公司合成，以此为模板，可以扩增得到不含信号肽的MsdS和MsdSHDEL基因片段。以酿酒酵母W303A基因组、质粒pTi-GFP和pTi-RFP为模板扩增得到KRE2、GFP和RFP基因。 用BamHI-EcoRI双酶切处理质粒pY26和MsdSHDEL，连接得到质粒pY26GPD-MsdSHDEL。再用SalI-XhoI处理质粒pY26GPD-MsdSHDEL和GFP基因，得到pY26GPD-GFP-MsdSHDEL质粒。依次对pRS424TEF质粒和KRE2、MsdS、GFP基因进行BamHI-SmaI、SmaI-SalI、SalI-XhoI双酶切处理，依次连接后得到质粒pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP。依次对pRS425TEF质粒和KRE2、RFP基因进行BamHI-SmaI、SmaI-PstI双酶切处理，再依次连接得到质粒pRS425TEF-Kre2-RFP。本实验用到的PCR引物和构建的质粒见表2和表3。

表1　菌株

1.1.2主要试剂与仪器

各种限制性内切酶、T4连接酶及N-糖苷酶F(PNGase F)试剂盒，大连宝生物公司；PCR引物及PCR产物纯化试剂盒，上海生物工程公司；PCR仪，日本TaKaRa公司；移液枪，德国Eppendorf公司；荧光倒置显微镜，日本Nikon。

1.1.3培养基配方

(1) 2×YT液体培养基：每升含酵母提取物10 g，蛋白胨16 g，NaCl 5 g；(2) YPAD液体培养基：每升含蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，腺嘌呤30 mg；(3) SD选择培养基：每升含酵母氮源基础6.7 g，葡萄糖20 g，灭菌后加入相应氨基酸缺陷型粉末；配制对应固体培养基需加入20 g/L的琼脂粉。配制含氨苄青霉素的培养基，氨苄需在培养基冷却至50 ℃左右加入，终质量浓度为0.1 g/L。含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基，终质量浓度为0.5 g/L，在60 ℃左右加入，60 ℃搅拌约1 h，至5-FOA完全溶解。

1.2荧光显微镜分析

从平板上挑取单菌落，接种于3 mL的液体培养基中培养至稳定期初期。离心收集细胞，用去离子水反复清洗2次，并用100 μL去离子水重悬。取5 μL的菌液于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光倒置显微镜上。选择合适的放大倍数和光源，用图像分析软件NIS-Element AR观察分析。

1.3细胞壁甘露糖蛋白中N-糖链的提取

挑取单菌落于100 mL液体培养基中培养3 d左右，离心收集细胞。用去离子水清洗细胞后，加入适量100 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH=7.0)重悬。121 ℃处理2 h，离心收集上清液，加入3倍体积的冰乙醇，充分混匀，室温静置30 min。离心弃上清液，并用70%的乙醇清洗2次，将获得的沉淀真空干燥，称重。然后用适量的去离子水溶解，使蛋白溶液质量浓度约为100 g/L。取20 μL糖蛋白溶液，加入适量缓冲液，用2 μL的PNGase F在37 ℃处理12～16 h。用Supelclean ENVI-Carb Cartridges填料的柱子纯化释放的N-糖链，冷冻干燥，-20 ℃保存。

1.4质谱分析

PA化糖链用纤维素石墨碳柱(Cellulose Cartridge Column)纯化处理，具体方法见Pyridylamination Manual Kit (Takara Code:D4480)说明书。先取1 μL PA化糖链溶液于不锈钢样品靶板表面，置于室温下干燥，再取1 μL 龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸，2,5-dihydroxy-benzoic acid,DHB)基质溶液于干燥后的氨基吡啶糖链化合物样品表面，室温下干燥结晶。

质谱分析条件：质谱仪：Bruker Daltonics ultrafleXtreme；控制软件：FlexControl；分析软件：FlexAnalysis versison 3.3；方法：RP700-3500 (reflective mode， positive) Smartbeam II(modified Nd:YAG laser),337 nm氮分子激光器。

表2　引物

注：酶切位点加粗表示；同源臂序列添加下划线。

表3　质粒

GPD:酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子; GFP/RFP:绿色/红色荧光蛋白基因。

2实验结果

2.1α-1,2-甘露糖苷酶在内质网的定位表达

利用HDEL序列(His-Asp-Glu-Leu)可以实现α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)在菌株内质网中的定位表达。HDEL序列是酿酒酵母内质网滞留信号，C-端含HDEL信号肽的蛋白会被从高尔基体中转运回到内质网，从而实现蛋白在内质网中的定位表达[16-17]。本研究以合成的MsdS基因为模板，扩增无信号肽且C-端添加HDEL信号的基因片段MsdSHDEL(如图1-a所示)，并在其N-端连接绿色荧光蛋白(GFP)，得到GFP-MsdSHDEL基因片段。将GFP-MsdSHDEL基因片段和由酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶强启动子(GPD)控制的GPDpr-GFP-MsdSHDEL基因片段在菌株KM(Δalg3::URA3)基因组中ALG3开放式阅读框位置进行表达。

设计同时具有ALG3基因上游或下游50 bp同源臂序列和GFP-MsdSHDEL基因5’端或3’端序列的引物F6/R6。以质粒pY26GPD-GFP-MsdSHDEL为模板，以F6/R6为引物，扩增得到带有ALG3开放阅读框上下游各50 bp同源臂的基因片段，通过线性DNA醋酸锂转化法将其转入KM菌株，涂布在YPAD平板上预培养，再影印到SD全培养基(含5-FOA)上。挑取转化子，培养并提取基因组，以F7/R7为引物，进行PCR验证，结果如图1-b所示(F7在ALG3上游设计取得，R7在GFP-MsdSHDEL片段500 bp左右设计取得)。对照组无条带，转化子有条带且长度为500 bp，证明作者得到了GFP-MsdSHDEL整合于酵母染色体基因组的菌株KM101(如图2所示)。采用相似的构建方法，得到GPDpr-GFP-MsdSHDEL基因在酵母染色体基因组整合表达的菌株KM201。

a-MsdSHDEL基因条带；b-GFP-MsdSHDEL阳性转化子的验证图1　GFP-MsdSHDEL基因片段在菌株KM中的整合表达Fig.1　Integrative expression of GFP-MsdSHDEL in KM strain(a. PCRamplification results of the MsdSHDEL gene. M: marker; 1: MsdSHDEL gene；b. Integrative expression of GFP-MsdSHDEL gene was confirmed by genome PCR. M: marker; 1: negative control; 2: positive transformants)

a-SD全培养基; b0SD培养基缺URA图2　URA3的敲除及GFP-MsdSHDEL基因的整合型表达Fig.2　The rescue of URA3(ALG3) marker and integrative expression of GFP-MsdSHDEL gene

同时将质粒pRS305GAPⅡ-RFPHDEL通过线性转化整合到菌株KM101基因组中，用于GFP-MsdSHDEL的荧光定位观察，结果如图3所示。在酵母细胞膜周内质网中均检测到绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，且二者位置吻合。证实了在菌株KM101中α-1,2-甘露糖苷酶定位在内质网中表达。

左：绿色荧光激发；中：红色荧光激发；右：重叠处理图3　α-1,2甘露糖苷酶内质网定位表达的荧光分析Fig.3　ER localization of MsdSp analyzed by fluorescence microscopy

2.2α-1,2-甘露糖苷酶在高尔基体的定位表达

酿酒酵母Kre2p(α-1,2-甘露糖基转移酶)是高尔基体滞留的II型跨膜蛋白，其内质网胞质一侧较短的N-端区域及跨膜域起到了高尔基体定位的作用，而内质网腔内侧的C-端区域则为蛋白活性催化区域[18]。因此，可以利用嵌合体蛋白Kre2-MsdS-GFP实现α-1,2-甘露糖苷酶在菌株高尔基体中的定位表达。通过融合PCR将去信号肽的MsdS基因与KRE2基因N-端部分(前300bp)及GFP基因整合起来，得到pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP质粒，并通过一步转化法将其转入Δalg3Δoch1Δmnn1菌株。为了对Kre2-MsdS-GFP嵌合体蛋白的高尔基体定位表达效果进行确认，同时在Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中表达pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP和pRS424TEF-Kre2-RFP质粒，得到菌株KG101，并对其进行荧光显微镜分析，结果如图4所示。

左：红色荧光激发；中：绿色荧光激发；右：重叠处理图4　α-1,2甘露糖苷酶高尔基体定位表达的荧光分析Fig. 4　Golgi localization of MsdSp analyzed by fluorescence microscopy

不论用绿色荧光激发还是红色荧光激发KG101菌株胞内都存在明显的呈不规则点状分布的荧光蛋白。对红绿荧光进行重叠处理后发现，绿色荧光和红色荧光所在的位置完全吻合，表明在KG101菌株中，Kre2-MsdS-GFP嵌合体蛋白被定位于高尔基体中表达。

2.3N-糖链结构的质谱分析

为了检测各种表达方式中α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果，作者采用MALDI-TOF-MS对N-糖链结构进行分析。结果如图5所示。除了Man5GlcNAc2(m/z=1335)和Man6GlcNAc2(m/z=1497)两种N-糖链以外，菌株中均存在质荷比(m/z)为1 013和1 175的峰。根据Glyco Workbench软件分析，质荷比(m/z)为1013的峰对应的N-糖链结构为Man3GlcNAc2，质荷比(m/z)为1 175的峰对应的N-糖链结构为Man4GlcNAc2。这说明3种菌株中表达的α-1,2-甘露糖苷酶都起到了一定的作用，能将Man5GlcNAc2型N-糖链进一步酶切得到酵母人源化核心N-糖链结构Man3GlcNAc2。此外，对比KM101、KM201和KG101菌株的质谱分析结果还可以发现，菌株KG101中Man3GlcNAc2型N-糖链所占的比例最低，说明高尔基体中定位表达的α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果不如在内质网中定位表达的α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果。而且，同样是在内质网中定位表达，含有强启动子GPDpr的菌株KM201中Man3GlcNAc2型N-糖链所占的比例明显高于KM101菌株，说明强启动子增加了α-1,2-甘露糖苷酶的表达量进而增强了其酶切效果。

A:菌株KM101N-糖链的质谱分析; B:菌株KM201 N-糖链的质谱分析; C:菌株KG101 N-糖链的质谱分析图5　菌株细胞壁糖蛋白N-糖链的质谱分析Fig.5　MALDI-TOF-MS analysis of the cell wall N-glycans

3讨论

N-糖基化修饰对蛋白质的生物活性至关重要，某些特定的糖链结构会参与一些免疫反应[3]。用哺乳动物细胞株可以生产含特定N-糖链结构的蛋白，进而研究糖链结构与蛋白活性的关系，帮助构建糖蛋白文库。但是即便得到糖蛋白的最佳结构，由于哺乳动物细胞培养条件要求高、表达量低等缺陷，限制了糖蛋白的批量生产。酵母发酵工艺的研究比较成熟，酵母细胞生长快，培养方法简单，表达量高，用酵母细胞批量生产糖蛋白具有一定的优势。

不同的酵母菌株N-糖基化途径的改造存在一定差异性。基本思路都是先消除酵母自身的高甘露糖基化，再构建人源化的糖基化途径。作者在前期研究中，通过构建Δalg3Δoch1Δmnn1菌株，获得均一的Man5GlcNAc2N-糖链[15]。再分别在内质网、高尔基体中定为表达来源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)，使重组菌中N-聚糖出现Man3GlcNAc2结构，并且通过强启动子GPDpr的调控，增加了Man3GlcNAc2型N-糖链所占比例。但是最终菌株仍存在糖链结构不均一的问题，为进一步的改造带来了困难，这也是酵母人源化表达体系构建中存在的普遍问题。HAMILTON[19]等在对毕赤酵母的改造中也遇到过相同问题。因此仍需通过进一步的研究以得到均一的Man3GlcNAc2N-糖链。在今后的研究中，作者将进一步在内质网中定位表达来源于人和其他生物的α-1,2-甘露糖苷酶，以期得到高纯度的Man3GlcNAc2型N-糖链。

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Expression of α-1,2-mannosidase fromAspergillussaitoiinSaccharomycescerevisiaeΔalg3Δoch1Δmnn1 mutant

DONG Ning-yuan，ZHANG Ge-yuan，XU Sha，GAO Xiao-dong*

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

ABSTRACTYeast N-glycosylation pathway was engineered to produce humanized glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae. After knocking out of ALG3, OCH1 and MNN1 genes, α-1,2-mannosidase from Aspergillus saitoi (MsdSp) was expressed in Saccharomyces cerevisiae for further humanization of N-glycosylation. Addition of HDEL at C-terminal of MsdSp and construction of Kre2p and MsdSp chimeric protein contributed to ER and Golgi localization. The MALDI-TOF-MS results demonstrated that strain KM201 (with GPDpr-msdsHDEL in the genome) produced more Man3GlcNAc2N-glycans. This research facilitates the humanization of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae.To produce humanized glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae, yeast N-glycosylation pathway has to be engineered. After knocking out of ALG3, OCH1 and MNN1 genes, α-1,2-mannosidase from Aspergillus saitoi (MsdSp) was expressed in Saccharomyces cerevisiae for further humanization of N-glycosylation. Addition of HDEL at C-terminal of MsdSp and construction of Kre2p and MsdSp chimeric protein contributed to ER and Golgi localization. The MALDI-TOF-MS results demonstrated that strain KM201(with GPDpr-msdsHDEL in the genome) produced more Man3GlcNAc2N-glycans. This research facilitates the humanization of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae.

Key wordsyeast; humanization; N-glycan; localization

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606001

基金项目：国家自然科学基金(21406087)

收稿日期：2015-12-31，改回日期：2016-03-12

第一作者：硕士研究生(高晓冬教授为通讯作者,E-mail:xdgao@jiangnan.edu.cn)。