雷帕霉素诱导成纤维细胞自噬在瘢痕疙瘩中的作用

陈 琳, 张 曦, 苏映军, 余 州, 雷 蕾, 郭树忠, 马显杰



实验研究

雷帕霉素诱导成纤维细胞自噬在瘢痕疙瘩中的作用

陈 琳, 张 曦, 苏映军, 余 州, 雷 蕾, 郭树忠, 马显杰

目的 探讨瘢痕疙瘩与正常皮肤中，真皮成纤维细胞层自噬水平的差异，并研究自噬诱导剂雷帕霉素对瘢痕疙瘩成纤维细胞Collagen Ⅰ及α-SMA表达的影响。方法 收集瘢痕疙瘩和正常皮肤临床标本，免疫组化和WB检测自噬标志物LC3的表达；雷帕霉素处理成纤维细胞，检测细胞Collagen Ⅰ及α-SMA表达。结果 瘢痕疙瘩中，LC3表达高于正常皮肤；雷帕霉素可诱导成纤维细胞自噬，并降低细胞Collagen Ⅰ及α-SMA的表达。结论 自噬与瘢痕疙瘩发病相关，雷帕霉素诱导自噬可以显著影响成纤维细胞合成胶原及向肌成纤维细胞分化的特性，干预细胞自噬可能是一种有效的治疗瘢痕的途径。

瘢痕疙瘩； 自噬； 雷帕霉素； 成纤维细胞; Collagen Ⅰ; α-SMA

笔者拟研究瘢痕疙瘩与正常皮肤中，自噬水平的差异，并探讨自噬诱导剂雷帕霉素对成纤维细胞的作用，以期为阐明自噬在瘢痕疙瘩中的作用提供理论依据，从而为寻求防治瘢痕疙瘩的方法提供新思路。

1 对象与方法

1.1 临床标本采集及处理 收集自2015年1月至2015年11月，来第四军医大学附属西京医院整形外科就诊的门诊和住院患者共计20例组织标本。瘢痕疙瘩13例，男性2例，女性11例，年龄9～43岁；正常皮肤7例，男性4例，女性3例，年龄3～40岁。标本采集前均征得患者知情同意，并签署同意书。瘢痕疙瘩组取材部位为上臂、足背、耳郭、腰背部；正常皮肤组为手指、腹部和腰背部(来我院行腹部整形、多指畸形及植皮术的患者)。标本取材后分为2部分，一部分行甲醛固定、石蜡包埋和免疫组化染色；另一部分保存于液氮中行组织研磨、蛋白裂解和Western blot检测。

1.2 主要试剂 雷帕霉素购自美国LC LABORATORIES公司；LC3α/β(ab58610)、Collagen Ⅰ(ab138492)、α-SMA(ab7817)购自美国ABCAM公司;β-actin抗体购自杭州华安生物公司;用于免疫组化的辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔二抗和DAB显色试剂盒购自福州迈新公司;用于WB检测的HRP标记的抗兔二抗和抗鼠二抗购自美国CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。

1.3 成纤维细胞分离培养 成纤维细胞分离培养采用组织块贴壁法，取无菌采集的人瘢痕疙瘩及正常皮肤组织，PBS洗涤去除血渍，剪除皮下脂肪组织，切成大小约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，接种于培养瓶中，待组织黏附牢固后，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养2、3 d后，去除漂浮组织，加入新鲜培养基。3～5 d后换液。待贴壁的成纤维细胞汇集率达到95%以上时，采用0.25%胰酶消化，传代。取第4～8代细胞用于后续的实验。1.4 雷帕霉素处理成纤维细胞 取培养至第4～8代的成纤维细胞按3×105个/孔的密度接种至6孔板，细胞汇合至85%时加入雷帕霉素溶液(DMSO溶解)，依据雷帕霉素的处理浓度实验分为5组：对照组、2.5 μm组、5.0 μm组、7.5 μm组和10.0 μm组。

1.5 免疫组化 常规石蜡切片后，脱蜡至水。加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗2次，用柠檬酸钠抗原修复液微波抗原修复20 min。5%BSA(PBS 稀释)封闭，室温孵育60 min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜。PBS 冲洗3次，5 min/次。滴加适当比例稀释的HRP标记二抗(1%BSA-PBS 稀释)，37 ℃孵育2 h。PBS 冲洗，5 min/次，冲洗3次。加入DAB显色液，镜下观察着色后自来水终止反应；苏木精染核，封片。

1.6 Western blot检测 组织研磨后，RIPA强裂解液裂解提取蛋白，BCA定量，标本沸水浴5 min行蛋白变性，放在含10%～12%分离胶的SDS-PAGE凝胶中电泳；转膜采用100 V恒压湿转法(PVDF膜)，脱脂奶粉室温封闭1 h，加入适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜，TBST洗涤4次，5 min/次，加入适当比例稀释的二抗，37 ℃孵育1 h，ECL发光，UVP化学发光仪(美国UVP公司)成像拍照。

2 结果

2.1 免疫组化和WB检测瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中LC3的表达 免疫组化结果如图1a所示，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3， LC3)阳性细胞呈棕黄色，LC3广泛分布在瘢痕疙瘩组织的真皮成纤维细胞层，而在正常皮肤组织，只在血管等管腔结构周围高表达。WB结果(图1b)与免疫组化结果一致，瘢痕疙瘩组织高表达LC3，正常皮肤组织低表达或不表达LC3。2.2 雷帕霉素增强成纤维细胞自噬 雷帕霉素处理瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts， KFB)和正常皮肤成纤维细胞(normal fibroblasts， NFB)，NFB在无药物刺激下LC3表达较低，不同浓度雷帕霉素处理NFB细胞48 h后，LC3Ⅱ表达显著升高，与未处理细胞相比，至少能提高4倍的表达量。相同浓度雷帕霉素处理KFB，LC3Ⅱ表达量最高只能提高约0.5倍(图2)。2.3 雷帕霉素降低成纤维细胞Collagen Ⅰ表达 NFB 自身Collagen Ⅰ表达量较低，低浓度雷帕霉素(2.5 μm)可增加Collagen Ⅰ表达，而高浓度雷帕霉素(10.0 μm)可降低Collagen Ⅰ表达；KFB 由于自身Collagen Ⅰ表达量较高，低浓度雷帕霉素对其不起作用，只有高浓度雷帕霉素(10.0 μm)可以降低KFB中 Collagen Ⅰ的表达水平(图3)。2.4 雷帕霉素降低成纤维细胞α-SMA表达 NFB基本不表达α-SMA；KFB自身高表达α-SMA，雷帕霉素处理KFB 48 h，雷帕霉素浓度越高，α-SMA表达越低(图4)。

3 讨论

瘢痕疙瘩是整形外科的常见病、多发病，不仅影响患者的外观，还可能导致受累部位发生功能障碍，严重影响患者的生活质量。由于瘢痕疙瘩具有发病机理不清、手术切除复发率极高、药物治疗不敏感等特点。因而，深入研究瘢痕疙瘩的发病机制，探寻安全、可行、有效的瘢痕疙瘩防治方法有着重要意义。

自噬是一种细胞自我降解的过程，目的是清除受损或多余的蛋白质和细胞器。在饥饿、能量缺乏、炎症、缺氧等应激状态下，自噬作为一种存活机制对于维持细胞稳态非常重要，然而，过度自噬则会导致细胞死亡，因此，自噬具有正反两方面作用[1]。本研究分析的指标中，LC3是监测自噬水平的特异性标志物。当自噬体形成时，胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)在自噬相关基因(autophagy associated gene，ATG)7和ATG12-ATG5-ATG16L的作用下，与磷脂酰乙醇胺共价结合形成膜型LC3(即LC3-Ⅱ)，结合在自噬体膜上[2]；α-SMA是肌成纤维细胞的标志，肌成纤维细胞已经被证实在肉芽组织收缩和瘢痕挛缩过程中起重要作用[3]。

图1 瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中LC3的表达(N为正常皮肤，K为瘢痕疙瘩) a.免疫组化结果(两步法，×100) b.WB检测 图2 雷帕霉素处理NFB和KFB 48 h后LC3表达的检测结果 a,b.Western blot检测结果 c,d.Western blot条带灰度值半定量分析 图3 雷帕霉素处理NFB和KFB 48 h后Collagen Ⅰ的表达 图4 雷帕霉素处理NFB和KFB 48 h后α-SMA的表达
Fig 1 Expression of LC3 in keloid and normal skin tissue(N: normal skin, K: keloid). a. Immunohistochemical analysis(Two-step method，×100). b. Western blot. Fig 2 Expression level of LC3 in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours. a,b. Western blot. c,d. Semi-quantitative analysis of LC3 Ⅱ protein expression. Fig 3 Expression level of Collagen Ⅰ in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours. Fig 4 Expression level of α-SMA in NFB and KFB after Rapamycin treatment for 48 hours.

同时，自噬在很多纤维化疾病的发生、发展中起重要作用。在Mao等[4]采用CCl4和胆汁管结扎诱导的肝纤维化模型中，自噬水平明显高于正常水平，这一结果与本文的研究结果类似；而在Gui等[5]采用博来霉素诱导的肺纤维化模型中，自噬水平低表达；另外，毛一雷等[6]的研究结果也表明，自噬现象在肝纤维化过程中减弱。蒋丽丽[7]通过研究发现，肾脏纤维化早期自噬水平显著增加，晚期显著减少，提示早期肾小管细胞受到轻度损伤时，增强自噬活性对抗损伤，形成自我保护机制，而晚期，肾小管细胞损伤过于严重失代偿，自噬活性减弱，自我保护作用失代偿；Shi等[8]检测了增生性瘢痕标本的自噬水平，较正常组织相比，增生性瘢痕自噬水平较低，这与本研究结果不一致。分析其原因：⑴其研究的侧重点是检测自噬在表皮层的表达情况，而本实验研究主要关注自噬在真皮层的表达情况；⑵增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在临床表现、组织病理学特点及转归等方面均存在差异；⑶增生性瘢痕在不同阶段组织病理学特点不尽相同，其结果可能会受此影响。总之，Shi等研究与本研究均观察到病理性瘢痕标本与正常皮肤标本自噬活性存在差异，提示自噬与病理性瘢痕的发生相关。

雷帕霉素是自噬的传统诱导剂，其通过抑制mTOR发挥作用。Wong等[9]采用雷帕霉素处理瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞后，进行全基因组测序，发现胶原合成基因PLOD、PCOLCE和P4HA降低，然而，其作用机制未做进一步研究，雷帕霉素作为一种高效的自噬诱导剂，是否通过自噬途径影响胶原合成基因的表达，需做进一步研究证实。本研究结果表明，雷帕霉素能够诱导NFB自噬，KFB自噬水平也有所提高，并进一步研究了雷帕霉素处理后成纤维细胞Ⅰ型胶原和α-SMA的表达。结果表明，雷帕霉素能够显著降低Ⅰ型胶原和α-SMA的表达，这与Ong等[10]的研究结果一致,但其作用的信号通路及作用机制还需进一步研究。

细胞外基质，尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与沉积过度、降解不足是导致瘢痕疙瘩形成的重要原因。Kim 等[11]研究表明，自噬相关蛋白Beclin1 基因缺陷小鼠体内胶原沉积增加，降低了小鼠原代肾小球系膜细胞自噬相关蛋白Beclin1 的表达，从而导致Ⅰ型胶原蛋白水平增加; Ishida 等[12]的研究发现,雷帕霉素通过抑制mTOR 诱导自噬，可以消除聚集的前胶原；肾上腺素受体β2 活化的心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原降解的增加与自噬水平的增加相关[13];在胶原基质应激下,特发性肺纤维化的成纤维细胞自噬活性低，抑制自噬促进细胞外基质产生[14]。综上所述，自噬在Ⅰ型胶原的产生与降解中起重要作用，诱导自噬可以促进胶原的降解。笔者采用雷帕霉素诱导自噬，结果显示Ⅰ型胶原表达量降低，也进一步印证了上述观点。

在正常情况下，肌成纤维细胞加速组织重塑和创面愈合。在纤维化疾病中，持续存在的肌成纤维细胞加速细胞外基质沉积，造成组织挛缩、变形、失去功能[3]。雷帕霉素的靶点mTOR与其他几种蛋白形成两种复合物mTORC1和mTORC2。有研究表明,采用无血清培养基饥饿人胚胎肺成纤维细胞(WI-38)达4 d时，MTORC1活性下降，自噬水平升高，MTORC2活性升高，进一步通过下游的CTGF加速成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，而加入雷帕霉素后抑制了MTORC2的活化，阻止了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化[15]。本研究结果表明，只加入雷帕霉素处理的情况下，雷帕霉素诱导自噬α-SMA表达下降，也阻止了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，然而，其确切的作用还需根据细胞所处的状况而定。本研究发现，雷帕霉素诱导KFB和NFB自噬的效果有较大差异，分析其原因可能与两种细胞内部雷帕霉素作用靶点mTOR的表达量不同有关。已有研究表明，KFB和NFB的mTOR活性不同，KFB的总mTOR和磷酸化mTOR均显著高于NFB[16]，因此，在一定浓度下，雷帕霉素对于KFB的作用相对较弱，诱导自噬的水平也相对较低。

总之，笔者经研究发现瘢痕疙瘩标本自噬水平高于正常皮肤，提示自噬与瘢痕疙瘩的发生相关；雷帕霉素诱导自噬可以显著降低成纤维细胞Ⅰ型胶原和α-SMA表达，从而影响成纤维细胞纤维发生特性。因此，自噬与瘢痕疙瘩的形成具有紧密的相关性，雷帕霉素等自噬干预剂有可能成为瘢痕疙瘩治疗的新手段，为瘢痕疙瘩乃至病理性瘢痕的治疗提供了新的治疗方向和策略。

[1] Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double-edged sword[J]. Science, 2004,306(5698):990-995.

[2] Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing[J]. EMBO J, 2000,19(21):5720-5728.

[3] Tomasek JJ, Gabbiani G, Hinz B, et al. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002,3(5):349-363.

[4] Mao Y, Zhang S, Yu F, et al. Ghrelin attenuates liver fibrosis through regulation of TGF-β1 expression and autophagy[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(9):21911-21930.

[5] Gui YS, Wang L, Tian X, et al. mTOR overactivation and compromised autophagy in the pathogenesis of pulmonary fibrosis[J]. PloS One, 2015,10(9):e0138625.

[6] 毛一雷, 陈蓉蓉, 杨华瑜, 等. 自噬现象在肝纤维化和肝切除时的表现形式[J]. 中国医学科学院学报, 2008,30(4):421-425.

[7] 蒋丽丽. 雷帕霉素对 UUO 大鼠肾脏细胞自噬及肾小管间质纤维化的影响[D]. 石家庄:河北医科大学, 2014.

[8] Shi JH, Hu DH, Zhang ZF, et al. Reduced expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 in hypertrophic scars[J]. Arch Dermatol Res, 2012,304(3):209-215.

[9] Wong VW, You F, Januszyk M, et al. Transcriptional profiling of rapamycin-treated fibroblasts from hypertrophic and keloid scars[J]. Ann Plast Surg, 2014,72(6):711-719.

[10] Ong CT, Khoo YT, Mukhopadhyay A, et al. mTOR as a potential therapeutic target for treatment of keloids and excessive scars[J]. Exp Dermatol, 2007,16(5):394-404.

[11] Kim SI, Na HJ, Ding Y, et al. Autophagy promotes intracellular degradation of type I collagen induced by transforming growth factor (TGF)-β1[J]. J Biol Chem, 2012,287(15):11677-11688.

[12] Ishida Y, Yamamoto A, Kitamura A, et al. Autophagic elimination of misfolded procollagen aggregates in the endoplasmic reticulum as a means of cell protection[J]. Mol Biol Cell, 2009,20(11):2744-2754.

[13] Aranguiz-Urroz P, Canales J, Copaja M, et al. Beta(2)-adrenergic receptor regulates cardiac fibroblast autophagy and collagen degradation[J]. Biochim Biophys Acta, 2011,1812(1):23-31.

[14] Nho RS, Hergert P. IPF fibroblasts are desensitized to type I collagen matrix-induced cell death by suppressing low autophagy via aberrant Akt/mTOR kinases[J]. PloS One, 2014,9(4):e94616.

[15] Bernard M, Dieude M, Yang B, et al. Autophagy fosters myofibroblast differentiation through MTORC2 activation and downstream upregulation of CTGF[J]. Autophagy, 2014,10(12):2193-2207.

[16] Syed F, Sherris D, Paus R, et al. Keloid disease can be inhibited by antagonizing excessive mTOR signaling with a novel dual TORC1/2 inhibitor[J]. Am JPathol, 2012,181(5):1642-1658.

Effects of Rapamycin induced fibroblasts autophagy in keloid

CHENLin,ZHANGXi,SUYing-jun,YUZhou,LEILei,GUOShu-zhong,MAXian-jie.

(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ZHANGXi,Email:xizhang@fmmu.edu.cn

Objective To survey the differences of autophagy between keloid and normal skin (NS), and to study the effects of autophagy inducer Rapamycin on the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA in keloid fibroblasts. Methods The clinical specimens of keloid and NS were collected, the immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of LC3 (the microtubule-associated protein 1 light chain 3 proteins), an autophagy marker; the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA in the fibroblasts treated by Rapamycin were detected. Results The expression of LC3 in keloid was higher than that in NS. Rapamycin can induce fibroblast autophagy, furthermore decreases the expression of Collagen Ⅰ and α-SMA. Conclusion Autophagy may associate with the pathogenesis of keloids. Rapamycin inhibits collagen Ⅰ production and myofibroblasts differentiation from fibroblasts through the autophagy pathway, which suggests that autophagy may be a promising target for keloid therapy.

Keloid; Autophagy; Rapamycin; Fibroblasts; Collagen Ⅰ; α-SMA

国家自然科学基金(81000840)

710032 陕西 西安，第四军医大学西京医院 整形外科

陈 琳(1985-)，河北清河人，研究实习员.

张 曦，710032，第四军医大学西京医院 整形外科，电子信箱：xizhang@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.016

R619.6

A

1673-7040(2016)02-0114-04

2015-12-28)