聚乙烯醇凝胶微球联合透明质酸注射填充的安全性研究

曾 立，周绍龙，汪海滨，孙中生，徐 翔，罗盛康



实验研究

聚乙烯醇凝胶微球联合透明质酸注射填充的安全性研究

曾 立，周绍龙，汪海滨，孙中生，徐 翔，罗盛康

目的 探讨聚乙烯醇凝胶微球联合透明质酸注射填充的安全性。方法 观察宝尼达透明质酸的显微结构，了解其内部聚乙烯醇凝胶微球的分布情况；将其与成纤维细胞共培养，观察其对细胞增殖的影响，以了解其生物毒性；将宝尼达透明质酸注射于C57小鼠的头皮下方，1个月后连同皮肤一块取材，进行F4/80染色，追踪注射后的组织学变化和炎症反应情况。结果 所选用的宝尼达透明质酸，由聚乙烯醇凝胶微球、羟甲基丙烯纤维素及透明质酸构成，成分均一，微球分布均匀；与细胞的共培养结果显示其并未影响成纤维细胞的增殖活性；注射于小鼠头皮下1个月，并未出现明显的包膜反应及炎症反应。结论 含有聚乙烯醇凝胶微球的注射用透明质酸填充剂质地均匀，不会影响细胞的增殖活性，也不会引起明显的炎症反应等并发症，具有良好的安全性。

宝尼达； 透明质酸； 聚乙烯醇凝胶微球； 安全性; 注射填充

透明质酸填充具有操作时间短，术后恢复快等优点,因此被广大求美者所青睐。然而，透明质酸填充的主要问题在于保存时间短，在注射后6～8个月需要重复注射，通过复合微球注射的方式，可以延长透明质酸的保存时间，使填充效果延长至注射后2～3年。自2013年1月至 2015年12月，广东省第二人民医院整形外科对宝尼达透明质酸注射填充材料的安全性进行了探讨。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验中所使用宝尼达透明质酸由生物可降解新材料北京市工程实验室联合EME LAB公司(加拿大)和天津南开大学共同研发，该产品于2010年10月获得国家药监局批准。规格为2支/盒，0.5 ml/支。

1.2 微观结构观察 取0.2 ml宝尼达透明质酸，置于EP管内，在EP管盖上方扎孔，放置于真空冷冻干燥机干燥过夜，24 h后取出，样品粘贴后进行镀膜，随后使用扫描电镜在不同放大倍数下进行观察。

1.3 对人皮肤成纤维细胞增殖活性的影响 采用MTT法测定，于96孔板选取36个孔，分为2组，其中实验组18孔内底部铺上宝尼达透明质酸50 μl，其上层接种人皮肤成纤维细胞，2000个/孔，5%CO2，分别在37 ℃孵育1 d、3 d及5 d后，实验组和对照组各选取6个孔，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测定OD490 nm波长的吸光值。

1.4 C57小鼠体内安全性评价 选取6周龄C57雄性小鼠共6只，行乙醚麻醉后，将0.2 ml宝尼达透明质酸注射到C57小鼠头皮下方。注射1个月后，用颈椎脱臼法处死C57小鼠，取下头顶部全层皮肤及皮下注射物。将标本置于4%多聚甲醛溶液中浸泡过夜，随后行梯度脱水和浸蜡包埋，切成8 μm薄片，进行HE及F4/80染色。

2 结果

2.1 微观结构观察 通过扫描电镜对宝尼达透明质酸进行微观观察，发现整体结构类似于蚁穴样分布，存在着大量的纤维网状结构。聚乙烯醇凝胶微球颗粒均匀分布在内，其直径范围为25～30 μm；透明质酸钠颗粒大小不等，最大直径约3 μm，散落分布在网状结构之中(图1)。

2.2 对成纤维细胞增殖活性的影响 实验组与对照组的OD值分别为孵育1 d后:0.61±0.03、0.650±0.05;3 d后:1.056±0.072、1.097±0.028；5 d后：1.360±0.120、1.320±0.150。各个时间点两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 注射至体内后的组织学变化 填充材料注射1个月后，皮肤表层未出现明显变化，组织结构正常排列，未出现异常组织增生及明显的炎症反应,在皮下深层可见均匀分布的透明质酸，其中可见散在的聚乙烯醇凝胶微球(图2);免疫组化标记F4/80显示在其周围有炎症细胞存在,还可见透明质酸下方与骨面相接处存在一层较薄的包膜(图3)。

图1 宝尼达透明质酸的微观结构 a.×50 b.×100 c.×500 d.×4000 图2 皮肤组织下方透明质酸和微球规则分布(HE ×200) 图3 微球周围的巨噬细胞(红色箭头)和骨面连接处的包膜(蓝色箭头，F4/80染色 ×200)
Fig 1 Microstructure of Bonita hyaluronic acid. a.×50. b.×100. c.×500. d.×4000. Fig 2 Regular distribution of Hyaluronic acid and microspheres beneath the skin tissue (HE ×200). Fig 3 Macrophagocyte around the microspheres(red arrow) and the envelope at the junction of the bone surface (blue arrow, F4/80 stain ×200).

3 讨论

填充材料的尺寸、形状、机械性能等会影响其在体内的表现。例如，小于70 μm的硅胶颗粒，容易从注射部位迁移并且引发相关并发症。然而，移植物的迁移潜能是决定其安全性的重要因素。巨噬细胞吞噬聚甲基丙烯酸甲酯颗粒具有尺寸依赖性。在体内，相比于尺寸介于50～350 μm间的颗粒，小于50 μm的聚甲基丙烯酸甲酯颗粒将诱导产生TNFα[1]。相比于球形，带有锐角如三角的颗粒也会引起较大的异物反应[2]。表面化学物质也会影响体内对注射物质的反应[3]。例如，带有两性或阴性基团的聚氨酯与带有阳性基团的聚氨酯相比，具有更低的体内炎症反应。类似的，被覆羧酸基团的聚丙烯颗粒，比被覆有氨基或者羟基的聚丙烯颗粒具有更低的炎症反应。颗粒属性也会影响体内填充剂的选择，例如，依据注射的部位、功能需求及渴望的保留时间，填充剂的刚度要求也会有所不同。用于治疗尿失禁的填充剂需要一定的刚度来保证力量；然而，面部填充剂需要一定的柔软度。透明质酸面部填充剂有较低的铰链度，但是保留时间较短[4]。透明质酸及其盐(HA)是人体皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，它由(1-β-4)D葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成，是一种链状聚阴离子黏多糖[5]。商品HA来源于动物组织或微生物发酵，广泛应用于食品、日化和医药领域。高纯度的医用级HA已被制成注射剂，用于眼科手术、骨科手术、预防术后粘连、治疗骨性关节炎和类风湿性关节炎。此外，也被用于面部注射美容，改进皮肤外观和结构、减轻皱纹、阻止皮肤衰老或改进唇部形状[6-10]。HA有良好的生物相容性，极少产生不良反应，与人工合成或其他天然来源的材料相比，该类材料制备的软组织填充产品更易于被接受，但由于其在体内很快被扩散和降解，难以维持理想效果。近年来，HA经修饰或交联后获得了一些毒性小、生物相容性好的抗降解产物，陆续被开发为多种医药产品，其中就有以含有聚乙烯醇凝胶微球为代表的宝尼达透明质酸，但是其生物相容性和具体生物反应缺乏充足证据。本文通过体外显微观察及体内动物实验的方法，进行详细的探讨，为其临床应用提供了指导。

笔者通过扫描电镜对宝尼达透明质酸进行微观观察，发现其整体结构类似于蚁穴样分布，存在着大量的纤维网状结构。直径范围为25～30 μm的聚乙烯醇凝胶微球颗粒均匀分布在内，透明质酸钠颗粒大小不等，最大直径约3 μm，散落分布在网状结构之中；其内所包含的聚乙烯醇凝胶微球等成分在与成纤维细胞共培养的情况下，并没有对细胞的增殖产生影响；另外，通过对注射1个月的标本进行炎症细胞追踪，发现其所引起的炎症反应轻微，在与自身组织直接接触的地方只产生较薄的包膜，在微球周围可见少量的炎症细胞浸润，可以起到长期刺激胶原增生的作用。因而，在应用于软组织填充时可以长久的维持其效果。

科学技术的不断进步为我们提供了大量可供选择的软组织填充材料，其中包含自体组织以及人工合成的生物材料。不同材料有着不同的适应证和适应人群，在进行具体应用时需要依据具体情况而定。本文所探讨的宝尼达透明质酸在进行软组织填充时，具有较好的生物相容性；与此同时，在微球周围又能够维持较轻程度的炎症反应，通过刺激胶原的增生以保证较长时间的填充作用。然而，其远期效果仍需更长时间及大样本的临床研究观察。

[1] Tous E, Weber HM, Lee MH, et al. Tunable hydrogel-microsphere composites that modulate local inflammation and collagen bulking[J]. Acta Biomater, 2012,8(9):3218-3227.

[2] Veiseh O, Doloff JC, Ma M, et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates[J]. Nat Mater, 2015,14(6):643-651.

[3] Bellis SL. Advantages of RGD peptides for directing cell association with biomaterials[J]. Biomaterials, 2011,32(18):4205-4210.

[4] Fakhari A, Berkland C. Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering, as a dermal filler and in osteoarthritis treatment[J]. Acta Biomater, 2013,9(7):7081-7092.

[5] Landau M, Fagien S. Science of hyaluronic acid beyond filling[J]. Plast Reconstr Surg, 2015,136(5 Suppl):188S-195S.

[6] Bertucci V, Lynde CB. Current concepts in the use of small-particle hyaluronic acid[J]. Plast Reconstr Surg, 2015,136(5 Suppl):132S-138S.

[7] 姜金豆, 张桂辉, 陈文娟, 等. 泪沟畸形矫正方法的临床探讨及疗效分析[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(9):555-557.

[8] 戴露倢, 吴卫华. 透明质酸与自体脂肪在鼻唇沟填充中的临床应用[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(8):488-489.

[9] 李春山. 双颞部透明质酸注射填充致右颞侧肿胀突起一例[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(1):61.

[10] 高宇, 李青峰. 透明质酸填充注射的并发症及处理[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(1):14-16.

Safety of injection filling with polyvinyl alcohol gel microspheres and hyaluronic acid

ZENGLi,ZHOUShao-long,WANGHai-bin,SUNZhong-sheng,XUXiang,LUOSheng-kang.

(DepartmentofPlasticSurgery,theSecondPeople'sHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510317,China)

LUOSheng-kang,Email:luoshengkang63@hotmail.com

Objective To investigate the safety of injection filling of polyvinyl alcohol gel microspheres combined with hyaluronic acid. Methods The microstructure of Bonita, containing polyvinyl alcohol gel microspheres was observed in vitro to determine the distribution of microspheres. In addition, its effect on cell proliferation was also observed by co-culture with fibroblasts, in order to understand the biological toxicity. At the same time, Bonita hyaluronic acid was injected beneath the scalp of C57 mice, and was harvested together with the skin at one month. Histological changes and inflammatory reactions were tracked by HE and F4/80 staining after injection. Results The Bonita hyaluronic acid used consists of polyvinyl alcohol hydrogel microspheres, hydroxymethyl propylene cellulose and hyaluronic acid structure with uniform components and homogeneous distribution of microspheres. The result of co-culture with cells demonstrated no effect on the proliferation activity of fibroblasts. There was little inflammation after one month. Conclusion Filler containing polyvinyl alcohol gel microspheres and hyaluronic acid with uniform texture was safe to use in this application and did not affect the proliferative activity of the cells or cause significant inflammation and other complications.

Bonita； Hyaluronic acid； Polyvinyl alcohol gel microspheres； Safety; Injection filling

510317 广东 广州，广东省第二人民医院 整形外科

曾 立(1989-),男，湖南湘潭人，医师.

罗盛康，510317，广东省第二人民医院 整形外科,电子信箱：luoshengkang63@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.017

R318

A

1673-7040(2016)02-0118-03

2015-10-16)