泰安地区鸡源致病性大肠杆菌流行病学调查与耐药性分析

宿志民 孙 燕（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）



调查报告

泰安地区鸡源致病性大肠杆菌流行病学调查与耐药性分析

宿志民 孙 燕（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

本调查对鸡场采集的疑似鸡大肠杆菌病例的相关病料进行大肠杆菌的分离鉴定，共分离鉴定出14株鸡源大肠杆菌，以微量平板凝集试验鉴定分离菌株的O抗原血清型，分别属于O78、O2和O1等3个血清型，其中O78（6/14）、O2（6/14）为主要流行血清型，占分离菌株总数的85.71%。选取了20种常用治疗肠杆菌病的抗生素对14株鸡源大肠杆菌分离株进行药敏试验，对14株大肠杆菌的β-内酰胺类耐药基因TEM、CTX-M-1基因及氨基糖甙类耐药基因acc（6'）-Ib、aph（3'）-IIa等耐药基因进行了PCR检测，鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。常引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎等一系列疾病，对养鸡业的危害很大。大肠杆菌易产生耐药性，养殖过程中不规范用药进一步加剧了耐药性的发展。药物敏感性试验表明，鸡源大肠杆菌耐药菌株越来越多，耐药谱也越来越广，甚至有的分离株对尚未广泛用于兽医临床的新型抗生素也表现出很强的耐药性。本研究对泰安地区几个规模化养鸡场分离到的大肠杆菌耐药性情况进行了系统的调查，以期揭示该地区鸡源性大肠杆菌病的流行情况和细菌的耐药状况，为该地区鸡大肠杆菌病的发生流行的有效控制提供可靠的理论依据

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.l 病料采集 自2013～2014年从山东省泰安市10个规模化鸡场疑似大肠杆菌感染病死鸡无菌采集的肝脏等脏器。

1.1.2 主要试剂 PBS缓冲液、LB培养基、麦康凯琼脂培养基、50×TAE电泳缓冲液、胰蛋白胨（Typetone）、大豆蛋白胨（Peptone-B）、酵母抽提物（Yeast extract）、琼脂（Agar）、氯化钠（NaCl）等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；肠杆菌科细菌生化常规鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；大肠杆菌O1、O2、O78、O133标准血清均购自中国兽药监察所。

1.1.3 供试药敏纸片 多粘菌素B、庆大霉素、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢他啶、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢西叮、头孢吡肟等19种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器和设备 PYX-DHS型生化培养箱、超净工作台、电子天平、电热恒温培养箱、高压灭菌锅、水平摇床 WD-9405B、PCR仪、DYYnl-3IA/3IB 型核酸电泳槽、DYYnl-2 型稳压稳流电泳仪、超纯水系统、凝胶自动成像仪、可调恒温水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板的制备 按常规及试剂说明制备，冷却后于放置37℃温箱中16～24h，检查无菌后置4℃冰箱中备用。

1.2.2 细菌的分离培养与纯化 从所采集具有典型大肠杆菌临诊症状和病理变化（败血症、包心、包肝等）的病死鸡的肝脏，无菌操作划线接种于普通培养基和麦康凯琼脂平板上37℃培养24h。挑取麦康凯琼脂平板上单个红色的菌落，再接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养24h，同时挑取单个红色菌落涂片、革兰氏染色、镜检。如此反复纯化3～4代，直到获得纯菌落为止。

1.2.3 生化试验 选取麦康凯琼脂平板上纯化好的红色单菌落，分别做各种细菌微量生化管，对糖发酵管要使管口稍下置于无菌平皿中，37℃培养18～24h。

1.2.4 药物敏感性试验（1）培养基制备：常规方法将LB培养基制成琼脂平板，置4℃冰箱中备用。（2）琼脂纸片扩散法：按世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby-Bauer氏法（即美国临床实验室标准委员会NCCLS的药敏试验方法）进行。（3）测试菌的制备：在普通营养琼脂平板上挑取2个相似菌落接种于2ml营养肉汤管，37℃培养2-6h，其浊度相当于0.5号麦氏标准，此时肉汤中细菌数约为1亿个细菌/ml，相当于1.5×108CFU/ml。（4）平板接种及贴加药敏纸片：用无菌棉拭子蘸取稀释液，在LB培养基上均匀涂抹，每次将平板转动60°，必须使细菌涂布均匀，最后用棉签涂抹琼脂平板边缘，盖上平皿盖，在室温下放置5min。用无菌眼科镊子在无菌状态下将20种药敏纸片贴于平板上，要求药敏纸片分布均匀，药敏纸片贴完15min后将平板倒置，置37℃温箱中培养16h-18h，观察结果。

1.2.5 耐药基因的PCR检测（1）基因的PCR扩增引物设计：下载GenBank中大肠杆菌耐药基因序列，使用Lasergene7.0软件分析，应用Primer5.0软件设计引物，扩增大肠杆菌中β-内酰胺酶基因和氨基糖苷类耐药基因，具体序列及扩增长度如表2所示。引物由上海生工公司合成。（2）PCR扩增：以本研究分离到的14株大肠杆菌全菌体菌液为模板，进行PCR扩增，反应体系如下所示：10×反应缓冲液2.5μl，Mg2+（25mmol/L）1.5μl，dNTPs（各10mmol/L）2μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，rTaq 0.5μl，ddH2O 15.5μl，共25μl，所用试剂均购自大连宝生物公司。将以上组分分别加入到ependoff管中，混和均匀后置于PCR仪中，按照以下程序进行扩增反应：预变性95℃5min，变性95℃1min，复性55℃50s，延伸72℃ 2min，共30个循环，终末延伸72℃10min。同时设立无模板的阴性对照。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与纯化

经37℃培养18～24h，分离菌在麦康凯琼脂平板上形成粉红色或红色、光滑、圆形隆起、边缘整齐，直径1.5～2.5mm的小菌落，见图1。

图1 鸡源大肠杆菌在麦康凯培养基上的生长状况

2.2 革兰氏染色镜检

挑取菌落及病料涂片经革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性、两端钝圆的短粗杆菌，多单在，偶有2～3个菌体连在一起，见图2。

图2 分离菌在显微镜下的形态（1000×）

2.3 生化试验

分离到的14株菌都符合大肠杆菌的特征，各菌均发酵大多数糖类（葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、果糖），产气产酸，不发酵蔗糖，VP试验阴性，MR试验阳性，三糖铁底层产酸，产生靛基质，尿素酶试验阴性。

2.4 血清型鉴定

应用微量平板凝集试验鉴定14株鸡源大肠杆菌分离株的O抗原血清型，结果显示分别属于O78、O2、和O1等3个血清型，其中O78（6/14）、和O2（6/14）为主要流行血清型，占分离菌株总数的85.7%。具体见表1。

表1 14株分离菌血清型鉴定结果 （%）

2.5 14株鸡源大肠杆菌药敏试验结果

按照前述方法，培养24h后，个别药敏片周围出现典型抑菌圈，见图3。药敏实验结果依据美国临床实验室国家标准化管理委员会（CLSI2008）标准判定敏感率、中介率、耐药率。药敏试验的统计结果见表2。

图3 药敏试验结果

表2 14株大肠杆菌对20种抗生素药物药敏试验结果（mm）

统计结果可知，14株大肠杆菌对多种头孢菌素类抗生素如头孢噻肟、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢唑啉均具有极高的耐药性。此外，14株大肠杆菌对庆大霉素、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、哌拉西林、氨苄西林等常用抗生素的耐药性也达到100%，对妥布霉素（92.9%）、氧氟沙星（85.7%）、氨曲南（85.7%）、头孢他啶（71.4%）及复方新诺明（64.3%）也具有较高的耐药性。这14株大肠杆菌仅对多粘菌素B（100%）、头孢西叮（100%）和复方新诺明（21.4%）的敏感性较高。

2.6 14株鸡源大肠杆菌的多重耐药情况

14株鸡源大肠杆菌的多重耐药情况统计结果见表3。

表3 14株鸡源大肠杆菌对20种药物的多重耐药情况

从表3可以看出，在14株鸡源大肠杆菌分离株中，有1株大肠杆菌对15种抗生素耐药，3株对16种抗生素耐药，5株对17种抗生素耐药，5株对17种抗生素耐药。由此可见，本研究中所分离到的大肠杆菌具有很强的耐药性。

2.7 大肠杆菌耐药基因检测结果

2.7.1 TEM耐药基因检测结果 以14株大肠杆菌全菌体为模板，以TEM引物进行PCR扩增，检测TEM基因的携带情况。结果表明，在14株分离菌株中，有9株大肠杆菌的TEM基因扩增出阳性，阳性率占总菌株的64.3%。扩增产物的电泳图见图4所示。

图4 14株大肠杆菌TEM基因扩增产物电泳

2.7.2 CTX-M-1耐药基因检测结果 以14株大肠杆菌全菌体为模板，以CTX-M-1引物进行PCR扩增，检测CTXM-1基因的携带情况。结果表明，全部14株分离菌株中均为阳性。扩增产物的电泳图见图5所示。

图5 14株大肠杆菌CTX-M-1基因扩增产物电泳

2.7.3 aph（3'）-IIa耐药基因检测结果 以14株大肠杆菌全菌体为模板，以aph（3'）-IIa引物进行PCR扩增，检测aph（3'）-IIa基因的携带情况。结果表明，在14株分离菌株中，有2株大肠杆菌的aph（3'）-IIa基因扩增出阳性，阳性率占总菌株的14.3%。扩增产物的电泳图见图6所示。

图6 14株大肠杆菌aph（3'）-IIa基因扩增产物电泳

2.7.4 acc（6'）-Ib耐药基因检测结果 以14株大肠杆菌全菌体为模板，以acc（6'）-Ib引物进行PCR扩增，检测acc（6'）-Ib基因的携带情况。结果表明，在14株分离菌株中，有13株大肠杆菌的TEM基因扩增出阳性，阳性率占总菌株的92.8%。扩增产物的电泳图见图7所示。

图7 14株大肠杆菌acc（6'）-Ib基因扩增产物电泳

3 讨论

（1）泰安市是山东畜牧养殖大市，家禽养殖量大，养鸡业发达。大肠杆菌病在山东省泰安地区的发病率较高，危害严重。为了解近年来泰安地区禽源大肠杆菌的血清型及其药敏特性，有针对性地开展禽大肠杆菌病的防治工作，本研究收集了在泰安地区多份疑似禽大肠杆菌病的病料，并进行了病原分离，血清型及生化鉴定。结果表明，本研究中分离得到的14株细菌都符合大肠杆菌的特征。对这14株鸡源大肠杆菌分离菌株菌株的血清型鉴定结果可以看出，O78和O2血清型出现的机率相对较高，均占比42.86%；O1血清型亦有分离，但所占比例不高。这与国内外研究报道的结果基本相符（范伟兴，1997；刘远飞，2008），这说明山东省泰安地区禽源大肠杆菌流行菌株在较长时期内，均保持一定的流行稳定性。（2）本调查采用最为常用的纸片法进行药敏试验，结果显示山东省泰安地区禽源大肠杆菌存在严重的耐药问题，分离到的14个菌株全部耐药，特别是对β-内酰胺类青霉素类和头孢菌素类药物表现为普遍的多重耐药。这14个菌株仅对头孢西叮、多粘菌素B、氨曲南、复方新诺明、妥布霉素、氧氟沙星和头孢他啶较为敏感；其中最敏感的药物为头孢西叮和多粘菌素B，其敏感率都达到了100%。本研究分离到的14株大肠杆菌对这两种抗生素均100%耐药，这可能是由于前几年养鸡场大量使用这两种抗生素，继而导致耐药细菌占据优势所致。这展示出泰安地区禽源大肠杆菌耐药性的复杂性和多变性，给兽医临床中大肠杆菌病的防控带来了新的挑战。综合上述数据，山东泰安地区临床分离的致病性大肠杆菌具有非常广泛的耐药谱，进行防治时应慎用上述β-内酰胺类青霉素类核头孢菌素类药物，一定要进行药敏试验，选择合适的敏感药物，不要盲目选用价格昂贵的药物。此外，在抗菌药物的选择上应考虑联合用药、交叉用药、轮换用药，一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效；另一方面可以避免细菌长期与某一种药物接触，增加产生耐药性机率。（3）在本研究中，通过对泰安地区分离的禽源大肠杆菌进行β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药基因的检测，为了解本地区养禽业在临床用药中合理选择抗生素、防止耐药菌的传播提供依据，具有重要的临床指导意义。检测结果表明14株大肠杆菌普遍携带β-内酰胺类耐药基因和氨基糖苷类药物耐药基因。其中，14株大肠杆菌均携带β-内酰胺类耐药基因CTX-M-1；9株大肠杆菌携带β-内酰胺类耐药基因TEM，阳性检出率为64.3%。此外，14株大肠杆菌均携带氨基糖苷类耐药基因acc（6'）-Ib，2株大肠杆菌携带氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-IIa，阳性检出率为14.3%。对于本实验扩增的耐药基因，有6株大肠杆菌携带2种耐药基因，6株携带3中耐药基因，2株携带4种耐药基因。本研究分离到的14株大肠杆菌携带耐药基因的比例很高，并且所携带耐药基因的情况与药敏试验的结果基本对应，这也在分子水平上解释了本研究中14株大肠杆菌具有极广耐药谱的原因，为有效控制大肠杆菌感染提供理论基础和科学依据。

参考文献

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中图分类号：S858.31

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2016）04-0036-04

收稿日期：（2016–01–25）