董酒大、小曲浸提液对酿酒微生物发酵产不饱和脂肪酸的影响

汤庆莉，刘　昕，吴天祥（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）



董酒大、小曲浸提液对酿酒微生物发酵产不饱和脂肪酸的影响

汤庆莉，刘昕，吴天祥
（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

摘要：董酒小曲中添加了90多味丰富的中药材，大曲中添加了40多味。分别以其为原料制备浸提液，作为酵母菌液态发酵的添加液，通过设立实验组（添加小曲浸提液）和对照组（不添加小曲浸提液）进行实验，30℃恒温发酵10d，10d后取实验组和对照组的发酵液分别进行甲酯化处理，随后进行气相色谱分析，测定溶液中肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸这5种不饱和脂肪酸的含量。实验结果表明，实验组中的5种不饱和脂肪酸的含量明显比对照组高，说明董酒酒曲对发酵过程中的不饱和脂肪酸的形成有一定的贡献作用。

关键词：董酒；酒曲浸提液；酿酒微生物；液态发酵；不饱和脂肪酸；白酒

优先数字出版时间：2016-05-17；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160517.1018.001.html。

中国白酒有着悠久而深厚的历史文化，中国老八大名酒中，董酒占有一席之地［1-4］。因其用来发酵酿造的大、小酒曲中总共添加了130多味中草药而被称为国密配方［5-6］。丰富的中药材融入酿酒的酒曲自然带来了许多丰富的成分。众所周知，制曲工艺中结合中药材也是我国传统白酒制曲传承的一大民族特色和科技大发明，其实现了中药材药用功效与白酒养生文化充分结合，实现药食双效的功用［7-9］。著名的医学宝典《黄帝内经》曾提出了“不治已病治未病，不治已乱治未乱”的核心思想。许多古典引“百草入曲”已传承至今，更是实现了药食结合产业化、规模化、效益化的发展。董酒添加了130多味名贵中药材制曲酿酒，是药用功效与酒体充分融合的代表，堪称传统白酒中的“黄帝内经”［10］。

不饱和脂肪酸是人体所需的一类物质，它对人体具有保健的功能，除一些食物中含有外，它也存在于白酒中，作为白酒中的微量成分及保健物质存在［11-13］。

本研究主要是以大、小酒曲为原料来制备浸提液，把其添加到发酵液作为酵母菌的底物来进行液态发酵，发酵周期10d，通过设立对照组，来比较大、小酒曲浸提液对酵母菌在发酵过程中形成微量物质不饱和脂肪酸含量的影响作用，进一步说明酒曲中添加了中草药，在一定程度上对某些物质的形成具有贡献作用。

1材料与方法

1.1材料

大、小酒曲：贵州董酒股份有限公司提供。

酵母菌XJ-4、DJ-5：分别从董酒小、大酒曲中分离筛选而得。

菌株活化培养基：YPD培养基。

种子液培养基：葡萄糖20%，蛋白胨20%，酵母膏10%，水1000mL，121℃灭菌20min。

液态发酵培养基：高粱、小麦粉碎后按高粱∶小麦∶麸皮=8∶1∶1的比例混匀，90℃下水浴糊化90min，冷却到60℃，按5 g α-淀粉酶∶100 g混合物的比例添加，液化1h。再按5 g糖化酶∶100 g混合物的比例添加酶活力为105 U/g的糖化酶，糖化1h，冷却至室温，用4层纱布过滤，收集滤液分装后，121℃灭菌20min。

1.2实验方法

1.2.1菌种活化

将分别保存在4℃冰箱中的斜面试管酵母菌DJ-5、XJ-4菌株，接入YPD培养基中，28℃恒温培养箱中培养2d，共活化2次。

1.2.2种子液培养

在分别装有100mL各种种子液培养基的250mL三角瓶中对应地接入2环已活化好的相应菌种，细菌种子液于30℃、180r/min条件下培养24h备用，酵母菌种子液于30℃、180r/min条件下培养48h备用。霉菌种子液于30℃、180r/min条件下培养48h备用。

1.2.3浸提液的制备及成分分析

分别称取10 g小酒曲于250mL干燥的圆底烧瓶中，用100mL的75%vol乙醇浸提。封口静置48h，过滤减压蒸去乙醇，再加入100mL的蒸馏水重溶，过滤。1 g酒曲可得10mL醇提液。醇提液用于液态发酵培养，其成分分析送至贵州省中科院药用植物园质谱室GC-MS分析完成。

离子流谱图分析方法：对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图进行检索，确定成分。并且用峰面积归一法来计算各成分的相对百分含量，以此来定性。

1.2.4摇瓶发酵培养

在装有90mL液体发酵培养基和10mL浸提液（大、小酒曲浸提液分别添加，设置为不同的实验组）的250mL三角瓶中，空白组为不添加浸提液的100mL液体发酵培养基。分别将各种种子液以5%的接种量接入到液体发酵培养基中，分别贴上标签，置于恒温30℃、180r/min条件培养10d，每天取发酵液测定其不饱和脂肪酸含量。

1.2.5发酵液甲酯化处理

取发酵液10mL于25mL具塞试管中，加入甲醇2mL，浓硫酸2滴，60℃水浴酯化30min。冷却后转入30mL分液漏斗中，依次加入5mL正己烷，2mL饱和NaCl，振荡1min，静置分层后收集有机相于25mL容量瓶中，水相连续用正己烷萃取2次，分别收集有机相于容量瓶中，定容后用于气相色谱（GC）进样分析。

1.2.6标品对照品储备液的配制

分别称取肉豆蔻油酸甲酯、棕榈油酸甲酯各100 mg，油酸甲酯、亚油酸甲酯、α-亚麻酸甲酯60 mg、88 mg、70 mg 于10mL的棕色容量瓶中，用正己烷定容，分别配成不同浓度的单标溶液。用封口膜密封置于-20℃冰箱冷冻储存。

1.2.7外标法标品对照品标准曲线的制作

用正己烷分别配制10 mg/L的5种不饱和脂肪酸甲酯的单标溶液。再配制100 mg/L的混标溶液。通过单点对照定性定量。初步估算发酵液中的各不饱和脂肪酸含量，然后分别配制出各自相应浓度的6个梯度混标溶液。气相色谱重复进样3次不同浓度梯度的混标溶液。以浓度和峰面积分别为横、纵坐标制作标准曲线。

1.2.8 RSD及回收率实验

测定了3个浓度梯度溶液的回收率（回收率=加标后测定浓度-空白浓度）/加标量浓度×100%），空白组不加标。平行进样3次求其平均值，并计算RSD，以此评价方法的准确性和重复性。

1.2.9气相色谱条件

KB-FFAP毛细管色谱柱（30m×0.32 mm×0.25μm）；Agilent 7890气相色谱仪柱箱程序升温条件35℃（5min）→7℃/min→100℃（2min）→10℃/min→220℃（4min），载气（N2）流速：0.4mL/min；H2流速40mL/min；空气流速400mL/min；尾吹：30mL/min；分流比：35∶1；进样口温度：240℃，FID检测器温度为260℃；进样量1.0μL。

2结果与讨论

2.1小酒曲浸提液GC-MS分析（图1、图2）

通过GC-MS分析得出的总离子流色谱图看出，大曲浸提液中共检测出了33种成分，小曲浸提液中共检测出了32种成分。其中大、小曲中主要成分几乎相同，有醇类、醛类、酯类及有机酸类。大、小曲浸提液中相对含量较多的是有机酸类。大曲浸提液中含量较高的是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，其相对含量分别为

图1小曲浸提液GC-MS总离子流色谱图

图2大曲浸提液GC-MS总离子流色谱图

图3标品对照品混标色谱图

饱和脂肪酸甲酯化后的含量奠定了基础。16.867%、1.418%、2.098%、20.456%、41.505%，小曲浸提液中含量较高的是丙三醇、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，其相对含量分别为26.231%、17.036%、1.000%、3.558%、29.384%、13.123%。其中不饱和脂肪酸总类中大、小曲浸提液均含有棕榈油酸、油酸、亚油酸，大曲浸提液含亚油酸相对丰富，小曲浸提液含油酸相对丰富。所以说明董酒在酿造的过程中，大、小曲都对董酒中的微量成分——不饱和脂肪酸有一定的贡献。

表1各标品对照品的回收率及RSD

2.2标品对照品的定性分析

从图3的标品对照品混标色谱图来看，5个标品峰均能在10min左右出峰完全，而且各标品峰形分离度好，相离较近的棕榈油酸甲酯和油酸甲酯均能满足定性定量要求。

2.3标品对照品标准曲线的制作、重复性及回收率实验

结合图4和表1来看，各标品对照品的标准曲线方程的R2均在0.998以上，说明各标准曲线的线性回归性较好。回收率在89%～98%之间，实验准确度比较可靠。从各标品对照品的RSD数据来看，各不饱和脂肪酸甲酯的重复性相对偏低，但是均可满足用来定性定量测定发酵液中其含量的重复性实验。其中α-亚麻酸甲酯在低浓度范围时，重复性相对较差。根据各标品对照品的标准曲线的线性回归性、回收率及RSD等建立了测定其含量的实验分析方法。因此为后期测定发酵液中的5种不

2.4酵母菌液态发酵产不饱和脂肪酸气相分析

从图5可以看出，酵母菌株DJ-5、XJ-4分别是从董酒大、小酒曲中以发酵性能综合指标筛选出来的酵母菌株，通过鉴定均属于异常威克汉姆酵母。纯种液态发酵实验中，发酵期为10d，每天取发酵液甲酯化后进行GC测定。通过测定得出，在发酵期为6d或7d时，5种不饱和脂肪酸的含量达到在整个发酵期的最大值。而无论是大曲浸提液组还是小曲浸提液组，实验组中不饱和脂肪酸含量均比对应的空白组高。各不饱和脂肪酸含量最大值：肉豆蔻油酸2.8614 mg/L±0.86 mg/L、棕榈油酸2.9790 mg/L±0.51 mg/L、油酸2.9073 mg/L±0.28mg/L、亚油酸9.5731 mg/L±0.47 mg/L、α-亚麻酸0.6488 mg/L± 0.63mg/L。由图5可看出，2株酵母菌相对应的各个不饱和脂肪酸的含量差异不大，但是，2组实验组添加的浸提液不同，小曲浸提液对菌株发酵期间产不饱和脂肪酸比大曲浸提液组的贡献作用突出。

3　结论

通过对董酒的大、小酒曲为原料进行浸提，在简单地定性了其浸提液的大致成分物质，从而通过分别添加2种浸提液到发酵液中，与不添加的形成对照。通过分析发酵过程中浸提液对酵母菌株在发酵过程产生不饱和脂肪酸含量的跟踪测定，结果表明，添加了浸提液的实验组确实比空白组产生的上述5种不饱和脂肪酸的含量多，2种浸提液中，小曲浸提液的贡献作用大于大曲浸提液。可能是由于小曲中添加的中药成分更多，这进一步说明董酒的酒曲不仅在酿造发酵过程中具有作用，而且可能还会带来一些健康的成分融入董酒中。

图4各标品对照品的标准曲线

图5酵母菌纯种液态发酵产不饱和脂肪酸含量图

参考文献：

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［5］刘昕，吴天祥，赵群丽.董酒大曲和小曲中酵母菌的筛选及发酵性能研究［J］.酿酒科技，2015（9）：37-39.

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Effects of Dongjiu Daqu Extract & Dongjiu Xiaoqu Extract on Unsaturated Fatty Acids Content in Fermentation Process

TANG Qingli，LIU Xin and WU Tianxiang
（School of Liquor-making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract:More than 90 kinds of traditional Chinese medicinal materials were added in Dongjiu Xiaoqu and more than 40 kinds of traditional Chinese medicinal materials added in Dongjiu Daqu for the preparation of Daqu extract and Xiaoqu extract respectively.Moreover，the extract was used as the adding liquid during liquid fermentation process（experimental group）.And liquid fermentation without the addition of Xiaoqu extract was the contrast group.After 10d fermentation at 30℃，the fermenting liquid in experimental group/ in contrast group underwent methyl esterification treatment.Then the content of five kinds of unsaturated fatty acids including nutmeg oleic acid，palmitic acid，oleic acid，linoleic acid and alpha linolenic acid was measured by GC.The analytic results suggested that，compared with the contrast group，the content of five kinds of unsaturated fatty acids in the experimental group increased evidently，which proved that Daqu/Xiaoqu made certain contributions to the formation of unsaturated fatty acids in the fermentation process.

Key words:Dongjiu；Daqu extract；liquor-making microbes；liquid fermentation；unsaturated fatty acids；Baijiu

中图分类号：TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0049-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016134

基金项目：“贵州董香型白酒酒体风格的研究”产学研合作项目（项目编号：DJ-H2014140506）。

收稿日期：2016-04-18

作者简介：汤庆莉（1967-），女，副教授，研究方向：发酵工程。

通讯作者：吴天祥（1965-），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为发酵工程，E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn。