糖尿病合并冠心病ZDF大鼠模型的构建

朱超，朱莹莹，李二妮，宋新峰，张志芹

（德州学院医药与护理学院，山东德州 253023）



研究报告

糖尿病合并冠心病ZDF大鼠模型的构建

朱超，朱莹莹，李二妮，宋新峰，张志芹

（德州学院医药与护理学院，山东德州 253023）

【摘要】目的 构建Ⅱ型糖尿病合并冠心病的大鼠模型。方法 采用高脂饲料喂养结合连续注射盐酸异丙肾上腺素（ISO）制备Ⅱ型糖尿病合并冠心病的Zucker糖尿病肥胖大鼠（Zucker diabetic fatty，ZDF）模型。通过血清肌酸激酶（CK）、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心电图ST波及心脏组织形态评价模型。结果 非DM模型组和DM-CHD组随给药次数增多CK表达逐渐升高，CK-MB表达先升高后下降，说明大鼠心肌损伤已形成。模型大鼠心电图II导联ST段的偏移表明心肌损伤已经形成。注射模型组大鼠心肌病理切片结果显示空白对照组大鼠心肌细胞正常，ZDF大鼠在被连续注射5 d ISO后心肌坏死面积达到心肌截面的1/2，10 d后心肌坏死面积达到心肌截面的3/4。结论 CK、CK-MB含量变化、心电图ST波变化和心肌病理切片显示造模已成功。ISO能造成一定程度的心肌损伤，可采用连续注射ISO进行冠心病模型的构建。本文建立了一种简便的采用高脂饲料喂养结合连续注射ISO的糖尿病合并冠心病大鼠模型的构建方法。

【关键词】糖尿病合并冠心病；大鼠；盐酸异丙肾上腺素；肌酸激酶；肌酸激酶同工酶

Ⅱ型糖尿病 （type II diabetes mellitus，type II DM）和冠心病（coronary heart disease，CHD）同属于代谢性疾病，具有共同的危险因子。研究表明［1］，高胰岛素血症是引起糖尿病和心血管疾病等代谢相关疾病的共同因素，而糖尿病合并冠心病后的乘积效应会加速动脉粥样硬化。CHD是糖尿病最常见而严重的并发症之一，是致使糖尿病患者死亡的主要原因，危害远大于糖尿病本身。CHD因其高致残率、高发病率和高致死率被称为人类健康的“头号杀手”，所以该病的早诊断、早治疗将大大降低疾病的危害，尤其在糖尿病患者中寻找有效的预防和治疗CHD的方法意义重大。因此，在基础医学研究中的动物模型构建是探索疾病发生发展过程、寻找有效治疗途径的重要环节。

研究中多以大鼠作为模型动物。大鼠对外源性胆固醇吸收率低，无胆囊，有自发动脉粥样硬化（AS）形成的特性，单纯高脂喂养很难产生AS病变［2］。多以药物诱导与高脂喂养和（或）损伤联合的方法造成AS病变［3-11］。现已培育出脂蛋白代谢基因缺陷鼠，使得大鼠在动脉粥样硬化模型的研究中重新受到高度重视［11］。大鼠AS病变的形态以及斑块的破裂位置与人类非常相似［12］。同时，大鼠冠脉侧支循环缺乏，心肌坏死出现较早，稳定性、重复性好，心肌梗死后与心力衰竭和临床心肌梗死的病理生理过程接近［13］。

Zuker糖尿病肥胖大鼠（Zuker diabetic fatty rat，ZDF rat）是常用的Ⅱ型DM模型动物［14］，其特征为肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、高血脂、高胰岛素血症、高血压。其肥胖与血脑屏障上的瘦素载体减少有关，瘦素与中枢神经系统受体结合能够启动调节摄食和机体能量平衡，此平衡如果被打破可导致肥胖发生，表现出糖尿病症状［15-19］。冠状动脉结扎是制备大鼠心肌病模型的常用方法，但是由于采用麻醉、手术等措施增加了造模难度和模型死亡率［20-23］。为降低模型构建难度和死亡率，本文尝试基于ZDF大鼠，采用高脂喂养结合连续注射盐酸异丙肾上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）的方法构建Ⅱ型糖尿病合并冠心病的动物模型。

1　材料与方法

ZDF大鼠，SPF级，雄性，8周龄，包括对照鼠（无糖尿病症状，体重230±10 g）与DM模型鼠（有糖尿病症状，体重340±10 g），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2012-0001］。培养条件：室温 （20±2）℃，湿度 （50± 20）%。按饲养动物的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂、材料与仪器

肌酸激酶 （CK）试剂盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒，购于南京安培化工科技有限公司；盐酸异丙肾上腺素注射液 （ISO，规格：1 mg/2 mL），上海禾丰制药有限公司生产；湘仪H2050R高压冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产；Thermo Fisher Multiskan MK3酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司生产；ACCU-CHEK Active血糖检测仪，德国罗氏诊断有限公司生产；ECG-1103LW VET心电图机，深圳凯沃尔电子有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠分组及模型制作

冠心病模型的构建参照已有文献报道，并稍做改动［24］。大鼠适应性喂养，非 DM鼠喂以普通饲料，DM模型鼠喂以高脂饲料 （Purina 5008）。2周后，测大鼠血糖值，非DM大鼠随机血糖值均小于11 mmol/L，DM大鼠随机血糖值均大于16.7 mmol/ L。将大鼠随机分成4组：① 空白对照组 （n=6）。非DM大鼠每天皮下注射生理盐水，连续10 d，第11天早晨采样；② 非DM模型组 （n=6）。非DM大鼠每天皮下注射ISO（1 mg/kg），连续10 d。分别于注射ISO 5、10 d后，即实验开始第6天（采样点1，造模5 d）、第11天（采样点2，造模10 d）早晨采样。③DM对照组（n=6）。患糖尿病大鼠每天皮下注射生理盐水（1 mg/kg），连续10 d，第11天早晨采样。④ DM-CHD组 （n=12）。患糖尿病大鼠每天皮下注射ISO（1 mg/kg），连续10 d。分别于注射ISO 5、10 d后，即实验开始第6天（采样点1，造模5天）、第11天（采样点2，造模10 d）早晨采样。采样点1、2采血进行血糖、CK和CK-MB的测定。采样点1处死半数大鼠，采样点2处死其余大鼠，取心脏做组织切片，观察形态。

1.3.2 血浆采集

采样前大鼠禁食12 h，可自由饮水。采用眼内眦取血法［25］，从各组ZDF大鼠眼内眦取血约0.5 mL至肝素钠化的1.5 mL离心管中，3000 r/min离心10 min，转移上层血浆，置于1.5 mL离心管中，肝素抗凝血浆直接用于CK和CK-MB的测定。取血用毛细管上的血可直接用于血糖检测。

5）课堂教学是以教师讲课为主的知识传授，方式比较单一。目前控制工程基础课程计划学时设置为54学时（其中6学时为实验），简单以教师授课效果来评价极为不公平。所导致的结果，一方面，学生的学习兴趣大大减弱，影响学生对基本知识的掌握；另一方面，教师讲授过于死板，课堂教授缺乏活力，难以调动学生的积极性。

1.3.3 酶活性检测

CK、CK-MB的分析分别采用CK试剂盒、CKMB试剂盒检测。采样点采集的血样肝素抗凝后分离血浆，立即用Thermo Fisher酶标仪在450 nm波长下测定CK和CK-MB含量。

1.3.4 心电图检测

对空白对照组、模型组第5天和模型组第10天ZDF大鼠于处死前进行心电图检测，每次采集5 min。观察II导联ST波的变化情况，记录ST波最大值（表1）。

2　结果

2.1 检测指标变化

2.1.1 CK活性变化

空白对照组和DM对照组的CK含量在第5天和第10天差异无显著性 （P＞0.05）。第5天非DM模型组和DM-CHD组的CK含量较对照组略高但并不显著（P＞0.05）。第10天非DM模型组和DM-CHD组的CK含量较对照组有显著升高（P＜0.01），且与第5天的CK含量差异有显著性 （P＜0.01）。随着ISO注射次数的增多，CK含量呈现显著升高，表明大鼠的心肌损伤已经发生。见图1。

图1　ISO对ZDF大鼠血浆CK含量的影响Note.Group 1：Control.Group 2：Model without DM. Group 3：DM Control.Group 4：DM-CHD.Fig.1 The effect of ISO on plasma CK in the ZDF rats

2.1.2 CK-MB活性变化

空白对照组和DM对照组的CK-MB含量在第5天和第10天差异无显著性（P＞0.05）。第5天非DM模型组和DM-CHD组的CK-MB含量较对照组有显著升高（P＜0.01）。第10天非DM模型组和DM-CHD组的CK-MB含量较对照组显著降低（P＜ 0.01），且与第5天的CK-MB含量差异有显著性（P ＜0.01）。随着ISO注射次数的增多，CK-MB含量呈现先升高后降低的趋势，表明大鼠的心肌损伤已经发生。见图2。

图2　ISO对ZDF大鼠血浆CK-MB含量的影响Note.Group 1：Control.Group 2：Model without DM. Group 3：DM Control.Group 4：DM-CHD.Fig.2 The effect of ISO on plasma CK-MB in the ZDF rats

2.1.3 血糖变化

采样点测量血糖值显示，非DM组随机血糖值均小于11.0 mmol/L，且各大鼠之间差异无显著性；DM组随机血糖值均大于16.7 mmol/L，且各大鼠之间差异无显著性。

2.1.4 心电图ST波变化

比较空白对照组和DM-CND组大鼠的心电图ST段最大值（mV）。DM-CHD第5天，与空白对照组（0.06 s＜QRS＜0.12 s）相比模型组大鼠心电图II导联ST段有显著下移现象且伴有QRS波群增宽（0.17 s＜QRS＜0.29 s），提示大鼠可能出现急性缺血性心肌损伤；DM-CHD第10天II导联ST波显著抬高，提示大鼠可能已由急性心肌缺血发展为急性心肌梗死，表明模型组急性缺血性心肌损伤已经形成［26-27］。此结果将在心肌组织形态变化中得到进一步验证。

2.1.5 组织形态变化

心肌病理切片结果显示空白对照组大鼠心肌细胞正常（图3 A）；DM大鼠在被连续注射ISO 5 d后即造成心肌损伤，主要病变为心内膜下心肌坏死，呈多灶性条索状、大片坏死，坏死面积超过心肌截面的1/2，坏死处细胞结构消失，有少许纤维母细胞和新生小血管（图3 B）；连续10 d注射ISO后，心肌损伤范围增大至心肌截面的3/4以上，坏死出炎细胞大量减少，纤维母细胞增多，出现肉芽组织增生修复（图3 C）。大鼠心脏组织形态变化符合心电图ST段偏移的提示结果。

表1　连续注射ISO对DM大鼠心电图II导联ST波的影响Tab.1 The effect of continuous injection of ISO on ST segment in the rat ECG part II（±s，n≥5）

表1　连续注射ISO对DM大鼠心电图II导联ST波的影响Tab.1 The effect of continuous injection of ISO on ST segment in the rat ECG part II（±s，n≥5）

注：与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；模型组第5天与第10天比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note.Compared with the control group：*P＜0.05，**P＜0.01.Model groups 5-days vs.10-days：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

采集时间/min Scan time/min 0.5　1　2　3　4　5空白对照组Control　0.03±0.02　0.03±0.02　0.05±0.03　0.04±0.02　0.04±0.03　0.03±0.02组别Groups DM-CHD组Group DM-CHD（第5天）（5 days）-0.11±0.04**　-0.12±0.08**　-0.15±0.09**　-0.15±0.10*　-0.17±0.08**　-0.13±0.05**DM-CHD组Group DM-CHD（第10天）（10 days）0.12±0.02**▲▲　0.14±0.03**▲▲　0.10±0.02*▲▲0.13±0.03**▲▲0.12±0.03**▲▲　0.11±0.02**▲▲

图3　连续注射ISO对心肌组织结构的影响Note.（A）Control group.（B）ISO injection for 5 consecutive days.（C）ISO injection for 10 consecutive days.Fig.3 The effect of continuous injection of ISO on the myocardial structure

3　讨论

心肌特异性酶是心肌损伤的标志物，对于心肌损伤诊断有非常重要的意义。CK通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与肌肉收缩、细胞内能量运转、ATP再生有直接关系的关键激酶，它能够可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应［28］。而ISO通过作用于心脏的β1和β2肾上腺素受体而产生作用，会产生正性肌力作用和变时性作用［29］。CK是心肌梗死的重要诊断依据和预报因子，尤其对心内壁下心肌梗死和心肌缺血的诊断比其他因素灵敏度高。急性发病时CK含量上升，且增高程度与心肌受损程度基本一致。对照模型组大鼠和DM模型组大鼠注射ISO后，血浆CK升高，表明ISO对心肌功能有一定程度的影响。

临床上认为特征性心肌损伤标志物CK-MB的水平，先升高后逐渐降低并伴随心电图ST段的抬高或下移，可以作为急性心肌缺血性损伤的诊断标准。CK-MB主要分布在心肌中，是心肌损伤的敏感指标。心肌损伤后在2～12 h内血清CK-MB活性急剧上升，一般持续2～3 d，在判断心肌损害上有一定灵敏性［30-31］。然而 CK-MB恢复正常的时间较快，故CK-MB诊断窗口期短，容易出现漏诊现象。ZDF大鼠注射ISO后，CK-MB水平先升高后降低，说明ISO能够对心肌造成一定程度的损伤。

心电图ST段的偏移是评价大鼠心肌缺血或心急梗死的重要指标［26-27，32-33］。本研究中心电图 ST段出现偏移，连续注射5 d ISO后大鼠心电图ST段显著下移并伴有QRS波群增宽，提示大鼠急性缺血性心肌损伤已形成。继续注射ISO至第10天，大鼠心电图ST段抬高，提示大鼠出现急性心肌梗死。心电图ST段的变化说明大鼠在连续注射ISO过程中由急性缺血性心肌损伤发展为急性心肌梗死。心脏组织形态结果进一步证实了心肌损伤的形成。

本研究中CK、CK-MB的含量变化、心电图ST段的偏移和心脏组织形态变化，都表明大鼠反复皮下注射ISO能够导致心肌损伤。以ISO作为诱导药物，以ZDF大鼠作为载体在糖尿病模型的基础上制备糖尿病合并冠心病动物模型具有较强的可操作性，简便、耗时短（24 d）、成模率高 （6只大鼠除1只死亡，5只出现心肌损伤，成模率大于80%）。以此方法构建的模型可用于糖尿病合并冠心病相关的基础医学实验，为早期诊断、致病机理、疗效评价等研究提供实验载体。

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Establishment of a Zuker diabetic fatty rat model of type II diabetic coronary heart disease

ZHU Chao，ZHU Ying-ying，LI Er-ni，SONG Xin-feng，ZHANG Zhi-qin
（College of Medicine&Nursing，Dezhou University，Dezhou Shandong 253023，China）

【Abstract】Objective The purpose of the present study was to develop an animal model of type II diabetic coronary heart disease in Zuker diabetic fatty（ZDF）rats.Methods The ZDF rat model of type II diabetic coronary heart disease was prepared by high-fat diet feeding combined with continuous injection of isoprenaline hydrochloride（ISO）in a dose of 1 mg·mL-1for 10 consecutive days.Serum creatine kinase（CK），and creatine kinase izozyme（CK-MB），ST segment in electrocardiogram（ECG）and myocardial pathological changes were detected to evaluate the rat model.Results CK of both the control and model groups was gradually increased with ISO injections，while CK-MB increased first and then decreased.The ST segment in ECG part II had significant changes.The pathological examination found that about half of the myocardial cross section in the model group was necrotic after injections of ISO for 5 days and more than 3/4 of the myocardial cross section was necrotic after injection of ISO for 10 days.The results indicated that ISO caused myocardial injury in ZDF rats.Conclusions The variation of CK-MB，CK，ST segments in ECG and myocardial necrosis indicate that the model is successfully established.The use of high-fat diet combined with continuous injection of isoprenaline hydrochloride in a dose of 1 mg·mL is a simple way to develop a Zuker diabetic fatty rat model of type II diabetic coronary heart disease.

【Key words】TypeⅡdiabetic coronary heart disease；Mouse；Isoprenaline；Creatine kinase；Creatine kinase izozymes

【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847（2016）02-0111-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.001

［基金项目］国家自然科学基金项目（No.81202502）。

［作者简介］朱超（1983-），男，讲师，博士。主要从事糖尿病及其合并症的代谢组学研究。Email：zhuchao830111@163.com

Corresponding author：ZHU Chao，Email：zhuchao830111@163.com

［收稿日期］2015-11-26