浓香型大曲中一株产Monacolin K红曲菌株筛选及鉴定

刘青青，任剑波，沈才洪，王松涛，喻学淳，曹振华，敖宗华（.四川理工学院，四川自贡64000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；.泸州老窖养生酒业有限责任公司，四川泸州646000；4.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）



浓香型大曲中一株产Monacolin K红曲菌株筛选及鉴定

刘青青1，任剑波2，4，沈才洪2，4，王松涛3，4，喻学淳3，曹振华1，敖宗华2，4
（1.四川理工学院，四川自贡643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；3.泸州老窖养生酒业有限责任公司，四川泸州646000；4.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）

摘要：为获得产Monacolin K红曲菌株，对10个不同来源的浓香型大曲样品进行分离纯化，共收集到18株红曲菌株。通过薄层层析法初筛及高效液相色谱法复筛，得到1株产Monacolin K菌株MY1，通过对其形态学鉴定和分子生物学鉴定，判断MY1为紫色红曲菌（Monascus purpureus）。

关键词：微生物；红曲菌；Monacolin K；筛选；鉴定

优先数字出版时间：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1439.007.html。

红曲菌（Monascus），在生物学的分类上属真菌界，子囊菌门，真子囊菌纲，散子囊菌目，红曲菌科，红曲菌属。红曲泛指红曲菌在蒸煮的米饭上发酵而成的紫红色产品。在我国自宋朝以来都有广泛应用，宋初《清异录》中即有“以红曲煮肉”的记载［1］。《本草纲目》中则记载红曲能“消食活血，健脾燥胃、治赤白痢下水谷。酿酒，破血行药势”［2］。

红曲中富含生物活性成分，其中以天然色素和降血脂成分Monacolin K应用最广泛［3］。自1976年日本学者远藤章从红色红曲霉发酵液中首次分离出高活性HM g-CoA还原酶抑制剂Monacolin K，发现其不但可作为降脂药物，还具有抑制肿瘤的功效以来，国内外科研工作者对红曲药用价值进行了大量研究［4］。目前，在欧美Lovastatin（即Monacolin K）已成为治疗高血脂症的首选药物之一。我国北大维信的血脂康胶囊和成都地奥的脂必妥片都是以功能性红曲（产品中Monacolin K超过0.4%的红曲）为原料制成的胶囊和片剂，目前功能性红曲在市场降血脂产品中有37.2%的占有率［5］。

据报道，泸州老窖国窖大曲曲坯各层中均匀分布着红曲霉［6］。为筛选得到产Monacolin K的红曲菌株，进一步开发利用浓香型大曲中有利资源，本次实验以泸州老窖浓香型大曲为样品，通过选择培养基分离、纯化，薄层层析法初筛和高效液相色谱法复筛，得到1株产Monacolin K的红曲菌株MY1。通过对其个体形态及菌落形态进行描述和鉴定，并提取其总DNA，利用分子生物学方法进行辅助鉴定，判定MY1为紫色红曲菌。以期为浓香型大曲中有益微生物的进一步开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种筛选样品

本次实验样品主要选取泸州老窖制曲车间堆积发酵过程中出现明显红色部位的大曲，共10个不同样品。

1.1.2试剂及仪器设备

主要试剂：麦芽浸粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、土豆、硫酸镁、硫酸锌、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、链霉素、过氧胆酸钠、乳酸、无水乙醇、琼脂粉、氯仿、环己烷、异丙醇、甲醇、磷酸等，其中，除甲醇为色谱纯外其余均为分析纯；蛋白胨、麦芽浸粉为生化试剂；Lovastatin标准品（瑞士Sigma公司）；真菌试剂盒（Omega）；PCR产物纯化试剂盒（杰瑞生物工程（上海）有限公司）等。

主要仪器：分析天平、立式高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、烘干箱、离心机、凝胶成像仪、紫外分光光度计、高效液相色谱仪等。

1.1.3培养基

麦芽汁培养基：麦芽浸粉130 g（加水至1000 mL煮沸）、琼脂粉18 g，乳酸调pH6.0，灭菌备用。

PDA培养基：200 g土豆洗净去皮，切成小块，加水1000 mL，煮至烂熟，8层纱布过滤，滤液定容至1000 mL，加入葡萄糖20 g，乳酸调pH6.0，灭菌备用。

察氏培养基：蔗糖20 g，NaNO33 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、K2HPO41 g、琼脂18 g，加水至1000 mL，乳酸调pH 6.0，灭菌备用。

液体种子培养基：葡萄糖60 g、蛋白胨25 g、MgSO41 g、NaNO32g、K2HPO41g、麦芽浸粉10g，加水至1000mL，乳酸调pH6.0，灭菌备用。

液体发酵培养基：葡萄糖60 g、籼米米粉20 g、Na-NO34 g、KH2PO43 g、MgSO41 g，加水至1000 mL，乳酸调pH 6.0，灭菌备用。

1.2实验方法

1.2.1红曲菌菌株筛选及纯化

将中高温大曲曲心处有粉红色菌落的部位分别粉碎，各加入稍淹没曲粉的无菌水，于30℃条件下恒温培养1 h，即成菌悬液。用无菌水将各菌悬液依次稀释至10-1～10-7共7个梯度，分别涂布在改良麦芽汁培养基平板上［7-8］。30℃恒温培养3～5 d，挑取具有红曲菌基本形态特征菌落，转接到改良麦芽汁培养基斜面相同培养条件继续培养，采用继代分离纯化法进行纯化培养［9］。

1.2.2产Monacolin K菌株的筛选

发酵液的制备：将分离纯化培养得到的菌株，转接至麦芽汁培养基斜面30℃培养5 d，取菌体制成孢子悬液，按6%接种量接种至液体种子培养基中，以200 r/min、30℃培养48～72 h，至种子液出现微红色即可。按5%接种量将种子液接种至液体发酵培养基中（装液量70 mL/ 250 mL），30℃、150 r/min条件下培养12 d。

发酵液前处理：取发酵液1 mL，加5 mL乙酸乙酯，30℃、150 r/min条件下振荡3 h，离心收集上清液，沉淀以5 mL乙酸乙酯抽提2次，合并上清液，蒸干；以少许苯溶解干燥物，待苯挥发干后，加入0.2 mL甲醇溶解，即完成发酵液前处理。

薄层层析法初筛：以硅胶为吸附剂，以环己烷∶氯仿∶异丙醇（V∶V∶V）=6∶3∶1为展开剂，取发酵液和Lovastatin标准品（Lovastatin标准品4 mg，0.2 mol/L NaOH溶液定容至100 mL，50℃超声转化1 h，室温放置1 h）各10 μL，以10%磷钼酸为显色剂，计算Rf值［10］。

高效液相色谱（HPLC）法复筛：色谱柱，20 RBA× SB C18，5 μm×150 mm×4.6 mm；柱温，28℃；紫外检测器238 nm检测波长；流动相，乙腈∶水=55∶45，磷酸调pH2.5；流速1.0 mL/min；进样量20 μL［11］。

1.2.3菌株的形态学鉴定

个体形态鉴定：对菌株进行电镜扫描，对比模式菌株电镜扫描图像对筛选菌株进行分析。

菌落形态鉴定：采用点植法分别接种于麦芽汁培养基、PDA培养基和察氏培养基平板上，30℃恒温培养7 d，观察并记录各单菌落形态特征。

1.2.4菌株的分子生物学鉴定

DNA提取：在无菌条件下，取一定量菌丝加入液氮研磨成粉末后，按真菌试剂盒（Omega）的提取方法提取总DNA。

PCR扩增：采用ITS1/ITS4作为真菌引物（ITS1：5'-TCCgTAggTgAACCTgC gg-3'，ITS4：5'-TCCTCCgCTTATTgATATgC-3'），对分离的菌种的ITS区域进行扩增。扩增程序：94℃预变性4 min；95℃变性4 s，53℃退火50 s，72℃延伸90 s，35个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检验，电压为12 V/cm，电泳时间25 min。采用PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物回收纯化，纯化后的PCR产物送至上海生工有限公司进行测序，测序结果提交NCBI进行序列比对，并建立系统发育进化树。

2结果与分析

2.1红曲菌筛选结果

红曲菌为腐生菌，耐乙醇，嗜酸，极喜乳酸，能在pH值为3.5～6.0范围生长，最低能耐pH2.5［12］。相对于其他微生物，红曲菌生长较慢。在平板分离纯化过程中易被其他丝状真菌覆盖而难以分离纯化，因此，本试验中采用改良麦芽汁培养基，即在普通麦芽汁培养基中加入10%无水乙醇，乳酸调pH5.0，抑制其他微生物的生长，加入0.3%的去氧胆酸钠抑制真菌菌丝蔓延，1 mg左右氯菌素使之特异性拮抗放线菌和细菌［13-14］。对不同样品红曲菌的分离纯化，共得到18株红曲菌，编号依次为MY1—MY18。

2.2产Monacolin K菌株筛选结果

用薄层层析法对得到的24株红曲菌发酵产物进行Monacolin K检测，结果显示MY1、MY13、MY16共3株菌在薄层层析后有清晰或较清晰斑点，为Monacolin K阳性菌株（见表1）。其余菌株发酵产物在同一薄层板上无与标样相同或相近Rf值的展开斑点。初步判断除该3株菌外其余菌株不具备产Monacolin K能力。

表1　　Monacolin K阳性菌株薄层层析法检测结果

应用HPLC法对3株Monacolin K阳性菌株发酵产物进行检测，其中仅MY1在14.272 min有吸收峰，与Lovastatin标准品出峰时间14.260 min相近，其余2株未发现与标准品相近的出峰时间（详见图1、图2）。综合薄层层析法和HPLC法的筛选结果判断，MY1为1株产Monacolin K的红曲菌株，Monacolin K含量为0.513mg/mL。

图1　　 Lovastatin标准品高效液相色谱图

2.3 MY1菌株的微生物学鉴定结果

2.3.1电镜扫描结果

对MY1进行活化培养后，通过电镜扫描，得到其个体形态，详见图3。

2.3.2不同培养基上菌落形态特征

30℃恒温培养7 d，MY1在不同培养基上菌落形态各异，参见表2和图4、图5、图6。

图2　　 MY1高效液相色谱图

图3　 MY1电镜扫描图

图4　 MY1在麦芽汁培养基上菌落形态

综合MY1的电镜扫描个体形态与不同培养基上菌落形态特征，并与李钟庆、郭芳编著的《红曲菌的形态及分类学》进行对比，判断MY1为红曲菌属菌株，将结合分子生物学方法为辅助鉴定手段，得出最终结论［12］。

2.4 MY1菌株的分子生物学鉴定结果

对MY1进行分子生物学测序，用ITS1/ITS4扩增其ITS区全长，PCR产物长度500～700 bp，再对500～700 bp左右PCR产物采用试剂盒对其进行割胶纯化。结果显示ITS基因序列长度为558 bp（图7）。将所得ITS序列分别与genBank中已有序列进行比对，并建立系统发育树（图8）。

表2　　MY1在不同培养基上菌落形态特征

图5　 MY1在PDA培养基上菌落形态

图6　 MY1在察氏培养基上菌落形态

图7　 MY1菌株基因序列图

根据分子生物学辅助鉴定结果可知，MY1与Monascus purpureus strain同源性最高，相似性为100%。结合MY1的电镜扫描图及在不同培养基上单菌落形态特征，最终鉴定MY1为紫色红曲菌。

3结论与讨论

以10个不同来源的大曲样品为原料，采用改良麦芽汁培养基分离纯化后，在收集到的18株红曲菌株中，通过薄层层析法初筛及HPLC复筛，共得到1株产Monacolin K菌株MY1，通过对其形态学鉴定和分子生物学鉴定，得出MY1的分类学地位为：真菌界（Eumycophyta），子囊菌门（Ascomycota），真子囊菌纲（Euascomyhcetes），散子囊菌目（Eurtotiales），红曲菌科（Monascaceae），红曲菌属（Monascus），紫色红曲菌（Monascus purpureus）。

一方面，因红曲菌代谢产物十分丰富，后续将对MY1的γ-氨基丁酸、麦角甾醇、桔霉素等其他代谢产物进行分析检测，以期为进一步研究红曲的相关功效提供依据。另一方面，MY1产Monacolin K能力与国内外文献介绍的相关红曲菌产Monacolin K能力还有一定差距，如Marlia Singgih等［15］对红曲菌MFR95固态发酵得到Monacolin K含量为1790 μg/g；刘月等［16］得到的红曲菌F12-11固态发酵Monacolin K含量达8.73 mg/g；Jun Zhang等［17］用红曲菌9901液态发酵得到Monacolin K含量为2026.0 mg/L。后续将对MY1红曲菌发酵理化条件进行优化，并充分利用现代基因工程技术提高MY1产Monacolin K的能力。

参考文献：

［1］傅金泉.中国红曲及其实用技术［M］.北京：中国轻工业出版社，1997：1-2.

［2］李雪梅，沈兴海，段震海，等.红曲生物活性研究进展［J］.时珍国医国学，2011，22（12）：2989-2991.

［3］Lin Y L，Wang T H，Lee M H，et al. Biologically active components and nutraceuticals in the Monascus-fermented rice：a review［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（5）：965-973.

［4］Endo A. Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species［J］. The Journal of Antibiotics，1979，32（8）：852-854.

［5］涂志英，邵伟.国内外红曲的应用现状及发展趋势［J］.中国酿

图8　 MY1系统发育进化树

造，2008（7）：7-9.

［6］姚万春，唐玉明，任道群，等.泸州老窖国窖曲坯层次间微生物差异研究［J］.酿酒，2005，32（5）：35-37.

［7］李绍亮，李亚凤，李学思.酿酒大曲中酯化红曲的分离及应用［J］.酿酒，2014，41（41）：32-38.

［8］王佳丽，韩建荣，赵景荣，等.汾酒大曲中红曲霉的分离和鉴定［J］.山西大学学报：自然科学版，2009，32（2）：289-293.

［9］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］4版.北京：高等教育出版社，2007.

［10］黑利生，周红杰，秘鸣，等.1株产洛伐他汀红曲菌的筛选和鉴定［J］.中国农学通报，2014，30（6）：314-320.

［11］全国食品工业标委会发酵分委会.功能性红曲米（粉）：QB/T 2847—2007［S］.北京：中国轻工出版社，2007.

［12］李忠庆，郭芳.红曲菌的形态及分类学［M］.北京：中国轻工业出版社，2003.

［13］吕旭聪，翁星，韩妙坤，等.福建红曲中红曲菌的分离鉴定及菌株特性研究［J］.中国食品学报2012，12（2）：89-96.

［14］李晓楼.大曲中红曲霉的简易分离方法［J］.中国西部科技，2008（7）：29-30.

［15］Singgih M，Saraswaty V，Ratnaningrum D，et al. The influence of temperature and ethanol concentration in Monacolin K extration from Monascus fermented rice［J］. Procedia Chemistry，2014，9：242-247.

［16］刘月，王璐，许赣荣.种间双亲灭活原生质体融合选育高产Monacolin K红曲菌［J］.工业微生物，2012，42（4）：54-59.

［17］Zhang J，Wang Y L，Lu L P，et al. Enhanced production of Monacolin K by addition of precursors and surfactants in submerged fermentation of Monascus purpureus 9901［J］. Biotechnology and Applied Biochemistry，2014，61（2）：202-207.DOI：10.13746/j.njkj.2016043

中图分类号：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0038-04

基金项目：四川省科技厅科技支撑项目《窖泥微生物混合菌群结构分析及酿造微生物的分离鉴定（省院科技合作）》，2015JZ0001。

收稿日期：2016-01-19

作者简介：刘青青（1990-），女，重庆人，在读硕士生，主要从事微生物及酿酒生物技术的研究。

通讯作者：沈才洪（1966-），男，教授级高工，四川省学术带头人，泸州老窖有限公司副总经理，总工程师。

DOI：10.13746/j.njkj.2016018 10.13746/j.njkj.2015442

Screening and Identification of a Monacolin K-producing Strain from Nongxiang Daqu

LIU Qingqing1，REN Jianbo2，4，SHEN Caihong2，4，WANG Songtao3，4，YU Xuechun3，CAO Zhenhua1and AO Zonghua2，4
（1.Sichuan University of Science & Engineering，Zigong，Sichuan 643000；2. Luzhou Laojiao Co.Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；3. Luzhou Laojiao Health Liquor Co. Ltd.，Luzhou，Sichuan 646000；4 National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Abstract：To obtain Monacolin K-producing Monascus strains，18 Monascus strains were isolated from 10 Nongxiang Daqu samples of difference sources. Through TLC primary screening and HPLC secondary screening，a Monacolin K-producing strain MY1 was finally obtained. It was identified as Monascus purpureus based on morphological identification and molecular biology features.

Key words：microbe；Monascus；Monacolin K；screening；identification