新型液态发酵生产米香型白酒的研究(Ⅲ)——纯种培养酿酒酵母与传统小曲协同糖化发酵的研究

唐取来，刘彩霞，肖冬光（教育部工业发酵微生物重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）



新型液态发酵生产米香型白酒的研究(Ⅲ)
——纯种培养酿酒酵母与传统小曲协同糖化发酵的研究

唐取来，刘彩霞，肖冬光
（教育部工业发酵微生物重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

摘要：在新型液态发酵条件下，对纯种培养酿酒酵母与传统小曲协同糖化发酵进行研究。实验结果表明，在传统小曲发酵过程中接种一定量的纯种培养的高产酯、适量低产高级醇的酿酒酵母，能明显提高原料出酒率和乙酸乙酯的含量，并显著降低高级醇含量；但酿酒酵母对产酸菌有明显抑制作用，致使总酸含量下降，并影响乳酸乙酯的生成。采用分醪发酵工艺可减少酵母菌与传统小曲协同糖化发酵过程中对产酸菌生长代谢的影响，在提高米香型白酒总酯含量的同时实现风味物质之间的平衡。

关键词：纯种培养酿酒酵母；传统小曲；液态发酵；白酒

优先数字出版时间：2016-03-23；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1517.004.html。

传统小曲作为米香型白酒酿造中微生物和生物酶的有效载体，在米香型白酒酿造过程中起糖化和发酵的作用，其质量的好坏直接影响米香型白酒的产量和质量，自古就有“曲乃酒之骨”之说［1］。但小曲制造过程是开放式的，很容易受自然环境因素的影响，而且小曲中除含酿酒有益微生物外，同时也夹带着对酿酒有害的微生物，最终会影响酒的质量［2］。因此，酿造过程中采用纯种培养的高产酯、适量低产高级醇的酿酒酵母与传统小曲协同糖化发酵，补充传统小曲中酿酒酶系和产酯功能微生物的不足，大幅度增加米香型白酒中酯类香味物质含量，同时还能有效控制高级醇的含量，从而改善小曲酒的品质［3］。传统小曲中的酿酒微生物经过长期的自然富集与传代，已形成了一个稳定的微生态环境，菌种间的相互促进和相互制约控制着白酒的风味特点［4］。但白酒发酵过程中微生物互生关系比较复杂，目前它们的互生机理还不十分清楚。因此，研究传统小曲中产酸菌与酵母菌的协同发酵机理，为传统酿造的技术改造提供重要的理论依据和实际应用价值［5］。

1材料与方法

1.1材料和仪器

小曲，南方传统小曲；大米，淀粉含量76.5%，湖南常德金健公司；高产酯、适量低产高级醇酿酒酵母（EY8），天津市工业微生物重点实验室；商品酶制剂，北京诺维信公司。

高效液相色谱仪、Agilent 7890B气相色谱仪、Agilent HP-INNOWAX色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：美国安捷伦科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1酿酒酵母种子培养

一级种子：从试管斜面接种1环高产酯、适量低产高级醇的酿酒酵母于装有5 mL玉米糖化醪培养基的20 mL试管中，30℃静止培养24 h，至产生浑浊状态；二级种子：将一级试管种子液全部倒入装有100 mL玉米糖化醪培养基的250 mL三角瓶培养中，30℃静止培养至菌浓度为1×108～2×108个/mL。

1.2.2小曲纯粮液态发酵工艺

粉碎后的大米经糊化、液化后，加小曲摇瓶培菌糖化1 d，静止发酵5 d，总发酵周期6 d。高产酯、低产高级醇酿酒酵母按不同工艺要求在培菌前后加入。米香型白酒分醪发酵工艺如下：

1.3分析方法

酒度测定：酒精计法［6］；总酸总酯测定：指示剂法，参照GB/T 10345—2007；风味物质测定：气相色谱法［7］。

2结果与分析

2.1纯种培养酿酒酵母对小曲纯粮液态发酵的影响

纯种培养酿酒酵母接种量与接种时间对小曲纯粮液态发酵的影响见表1。

表1　纯种培养酿酒酵母对小曲纯粮液态发酵的影响

从发酵醪酒度看，培菌糖化前接种1%～2%的酿酒酵母，发酵醪酒精含样量有所提高，比空白对照提高5%左右；其他条件与对照样基本相当。

从醇类风味物质看，接种纯种培养酿酒酵母后，正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量明显减少，而苯乙醇的含量有所增加。其中，培菌糖化前接种1%的酿酒酵母时，正丙醇、异丁醇、异戊醇和总高级醇含量减少最多，分别比对照样减少65.7%、80.8%、38.7%和57.7%；苯乙醇的含量随酵母接种量增大而增加，在培菌糖化前接种5%的酿酒酵母时，苯乙醇含量最高达76.5 mg/L，分别为对照样和培菌后接种的2.0倍和1.4倍。

从酯类风味物质看，接种纯种培养酿酒酵母后，乙酸乙酯含量显著增加，其含量随酵母接种量增加而增加，且培菌糖化前接种比培菌糖化后接种提高更显著。培菌糖化前接种5%的酿酒酵母时，乙酯乙酯含量最高达1114.2 mg/L，分别为对照样和培菌后接种的16.6倍和2.6倍。但酿酒酵母对乳酸乙酯的生成有明显影响，其中培菌糖化前接种酿酒酵母，乳酸乙酯的生成被完全抑制；培菌糖化后接种5%的酿酒酵母时，乳酸乙酯含量下降22.8%。

从总酸看，接种酿酒酵母后影响产酸菌的生长与代谢，发酵醪总酸含量显著降低，且随养酵母接种量的增加，总酸含量相应减少。

2.2米香型白酒分醪发酵工艺研究

由上述的结果可知，在小曲纯粮液态发酵工艺中接种纯种培养酿酒酵母，虽然能大幅度提高米香型白酒中的乙酸乙酯含量，但酿酒酵母对小曲中的产酸菌有明显抑制作用，致使总酸含量下降，并影响乳酸乙酯的生成和酒体风味物质之间的平衡。为此，采用分醪发酵工艺，部分发酵醪保留纯小曲发酵，而另一部分发酵醪采用高产酯、低产高级醇酿酒酵母与小曲共同发酵。不同发酵工艺的试验结果见表2。从表2可知，培菌糖化后按1∶1比例合醪发酵工艺A并没有消除酿酒酵母对产酸菌的抑制作用，总酸和乳酸乙酸含量与培菌前接种1%酿酒酵母的对照2相同。发酵1 d后，再按1∶1的比例合醪发酵工艺B，可明显提高总酸和乳酸乙酯含量，总酸提高为对照2的33.3%；而酒度比对照1提高10.4%，乙酸乙酯提高18.7倍左右，高级醇下降33.8%。

表2　不同发酵工艺试验结果

上述结果可以看出，纯种培养酿酒酵母与传统小曲协同发酵和分醪工艺相结合的方式能达到增酯降醇的效果，但发酵生成的乙酸乙酯含量仍远高于乳酯乙酯，致使乙酸乙酯、乳酸乙酯比有所失调。将通过改变发酵时间、合醪比例和合醪时间来协同酿酒酵母与传统小曲的糖化发酵，达到白酒风味物质平衡的目的。

2.2.1延长发酵时间对发酵的影响

表3为纯小曲培菌（小曲0.8%）与共同培菌（小曲0.8%和酵母1%）结束并发酵1 d后按1∶1的比例合醪发酵，延长发酵时间后的试验结果。从结果看，随发酵时间的延长，酒度、乳酸和乙酸含量变化不大；乙酸乙酯在发酵11 d时达最大值，比发酵7 d时提高10.3%，随后缓慢下降；乳酸乙酯含量随发酵时间的延长缓慢增加，发酵17 d的乳酸乙酯含量与发酵7 d的相比，提高了19.0%。

表3　延长发酵时间对发酵的影响

从实验结果可以看出，乙酸乙酯主要在前期生成，发酵后期会有部分降解；而乳酸乙酯主要在后期生成。由于发酵一定时间，乳酸菌和酵母协同发酵达到微生态环境的饱和状态，当继续延长发酵时间，发酵液中各代谢产物的含量基本稳定。从结果看，延长发酵时间，可适当调整乙酸乙酯与乳酸乙酯的比例，但要达到合适的比例；若发酵时间过长，则效率会下降。

2.2.2合醪比例对发酵的影响

在保持总发酵时间6 d不变的情况下，不同合醪比例对发酵的影响见表4。从结果看，随着不加酵母醪液比例的增大，酒度、乙酸乙酯含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相应的减小，而总酸和乳酸乙酯含量相应的增加。在合醪比例为7∶3时，与对照1相比，酒度、乙酸乙酯和总酯的含量分别提高5.6%、8.4倍和2.8倍，高级醇下降了24.9%；而与对照2相比，乳酸乙酯、乳酸和总酸分别提高13.2倍、3.0倍、2.3倍。

2.2.3合醪时间对发酵的影响

按7∶3的合醪比例，不同合醪时间对发酵的影响见表5。从结果看，随合醪时间的延长，乙酸乙酯和总酯的含量及乙酸乙酯、乳酸乙酯比相应的减小，但乳酸乙酯、高级醇、总酸和乳酸的含量相应增加。当各自发酵48 h后再合醪，乙酸乙酯与乳酸乙酯的比例相对平衡，此时的乙酸乙酯、乳酸乙酯比为1.69。以此发酵醪蒸馏所产的白酒，米香纯正，酒体醇和协调。

3　结论

3.1在传统小曲发酵过程中接种一定量的纯种培养的高产酯低产高级醇酿酒酵母，能明显提高乙酸乙酯的含量，并显著降低高级醇含量；但酿酒酵母对产酸菌有明显抑制作用，致使总酸含量下降，并影响乳酸乙酯的生成，其中，在培菌糖化前接种酿酒酵母后，乳酸乙酯的生成完全被抑制，其结果使酒体风味物质之间失去平衡。

3.2采用分醪发酵工艺可减少酵母菌与传统小曲协同糖化发酵过程中对产酸菌生长代谢的影响，分别培菌并发酵一定时间再合醪发酵，其乳酸乙酯含量比纯小曲发酵的还有所提高。纯小曲培菌液（小曲用量0.8%）与共同培菌液（小曲用量0.8%，酵母培养液1%）按7∶3比例，各自发酵48 h后，再合醪发酵，与纯小曲发酵（对照）比较，总酸含量相当，酒度、乙酸乙酯、乳酸乙酯、总酯的含量分别提高7.0%、6.2倍、6.9%、2.3倍，高级醇含量下降16.5%，乙酸乙酯、乳酸乙酯比从0.28提高至1.69，在大

表4　合醪比例对发酵的影响

表5　合醪时间对发酵的影响

注：对照1为纯小曲发酵；对照2为小曲与酵母共同发酵，培菌前接种1%的纯种培养酿酒酵母；合醪时间指培菌糖化结束后的发酵时间。

幅度提高米香型白酒总酯含量的同时实现了风味物质之间的平衡，提升了米香型白酒的品质。

参考文献：

［1］康珺，倪江波.四川酒文化的剖析［J］.商业文化，2010，2010（2）：97-98.

［2］吴赫川，马莹莹，杨建刚，等.川法小曲白酒发展现状及其瓶颈问题分析［J］.安徽农业科学，2014，42（33）：11850-11853.

［3］唐取来，李晶晶，李玲玲，等.新型液态发酵生产米香型白酒的研究（I）——酶制剂在液态发酵米香型白酒中的应用［J］.酿酒科技，2015（9）：8-11.

［4］蒋红军.茅台酒生态环境中酿造微生物多样性的研究及展望［J］.酿酒，2003，30（4）：22-24.

［5］李凯，彭敦磊，孙端方.传统大曲微生物多样性技术研究［J］.酿酒科技，2015（9）：33-36.

［6］牟建楼，王颉，张伟，等.乙醇的测定方法综述［J］.酿酒，2006，33 （2）：46-48.

［7］张超，胡可萍，端裕树，等.快速气相色谱法分析白酒中的香味组分［J］.色谱，2007（4）：586-589.

中图分类号：TS262.3；TS261.1；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0035-03

基金项目：国家自然科学基金资助项目（3147172）；中国白酒3C计划项目。

收稿日期：2016-01-12

作者简介：唐取来（1991-），女，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方向为现代酿造技术。

通讯作者：肖冬光（1956-），教授，博士生导师，E-mail：xdg@tust.edu.cn。

Production of Mixiang Baijiu by New-Type Liquid Fermentation（III）：Cooperative Sacchariferous Fermentation of Pure-Bred Cultured Yeast and Traditional Xiaoqu

TANG Qulai，LIU Caixia and XIAO Dongguang
（Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The cooperative sacchariferous fermentation of pure-bred cultured yeast and traditional Xiaoqu was studied in the conditions of newtype liquid fermentation. The experimental results demonstrated that，the inoculation of proper amount of pure-bred cultured yeast with high yield of esters and low yield of higher alcohols in traditional Xiaoqu fermentation process could significantly enhance liquor yield and ethyl acetate content and decrease the content of higher alcohols. However，the obvious inhibiting effects of yeast on acid bacteria would reduce total acids content and influence the synthesis of ethyl lactate. The use of mash-divided fermentation could reduce the inhibiting effects on the growth and metabolism of acid-producing bacteria in the cooperative sacchariferous fermentation and enhance total esters content，meanwhile，the balance among flavoring compounds could be achieved.

Key words：pure-bred cultured yeast；Xiaoqu；liquid fermentation；Baijiu