响应面优化细菌产吡嗪类工艺

武　顺，闫寅卓，韩兴林，王德良（中国食品发酵工业研究院，北京100015）



响应面优化细菌产吡嗪类工艺

武顺，闫寅卓，韩兴林，王德良
（中国食品发酵工业研究院，北京100015）

摘要：对细菌产吡嗪类化合物的工艺进行研究。以从酒曲中筛选的细菌出发，考察不同因素对细菌产吡嗪的影响。采用单因素实验和响应面法对影响细菌产吡嗪的4个主要影响因素即葡萄糖、摇床转速、时间和装液量进行分析优化。结果表明，影响细菌产吡嗪的工艺因素按主次顺序排列为葡萄糖＞转速＞时间＞装液量；确定细菌产吡嗪的最佳工艺条件为葡萄糖70 g/L、转速165 r/min、时间40 h、装液量70 mL。在此最佳条件下吡嗪类的产量提高23.5%。本研究采用酒曲中筛选的高产蛋白酶活性和3-羟基丁酮的双高细菌，相对于只研究单一活性高的细菌具综合性且产量显著。

关键词：吡嗪；响应面；工艺优化；白酒

优先数字出版时间：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1451.011.html。

吡嗪类是中国白酒中的重要风味化合物，国外的研究表明，吡嗪类的化合物有预防心血管疾病的作用［1］。其中四甲基吡嗪（tetram-ethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪（Ligustrazine），川芎嗪的药理作用主要有扩张血管、调节脂质代谢等作用，具有坚果、烘烤香气［2］，被广泛应用于食品加工行业［3］。作为中国白酒中健康的风味成分，其来源得到了极大的关注。吡嗪类化合物是1位、4位含2个氮杂原子的六元杂环化合物，并有气味强度高、阈值低、风味独特、特殊药理功能和保健功能等特点，广泛存在于天然和发酵食品中，具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气，香气透散性好，对其他香味有显著的烘托和叠加作用［4-5］。

本实验以从酒曲中筛选的蛋白酶活性和3-羟基丁酮双高的细菌为基础，对其产吡嗪量进行实验优化。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

1.1.1材料

基础培养基：营养肉汤培养基。

发酵培养基：葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、氯化锰0.05 g/L、氯化镁0.15 g/L、氯化锌0.1 g/L、氯化铁0.05 g/L。

1.1.2仪器与设备

气质联用仪，美国PerkinElmer公司，购于上海安谱科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DHZ-B高温全温振荡器，太仓市豪成实验仪器制造有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计，岛津公司。

1.1.3主要化学试剂

肌酸，北京雅安达生物技术有限公司；甲萘酚，国药集团化学试剂有限公司；3-羟基丁酮，百灵威科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 L-酪氨酸标准曲线［6-8］的绘制

（1）称取预先以105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，准确至0.0002 g，用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL L-酪氨酸标准溶液。

（2）吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液。

（3）分别取上述溶液各1.00 mL（3个平行实验），各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂溶液1.00 mL，置于40℃±0.2℃水浴中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm下，10 mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。操作见表1。

表1　　L-酪氨酸标准曲线制作

1.2.2 3-羟基丁酮标准曲线的绘制

3-羟基丁酮在碱性介质中可以与肌酸反应生成红色的化合物，甲蔡酚可以促进和加速红色物质的生成，该化合物在范围内有最大光吸收，在一定的范围内，光吸收与3-羟基丁酮含量成正比。取8支比色管洗净烘干，按表2加入标准溶液及显色剂，以60℃水浴15 min，分光光度计530 nm下比色，绘制标准曲线。

表2　　3-羟基丁酮标准曲线制作

1.2.3产吡嗪的测定

利用气相色谱质谱联仪进行检测。

2结果与分析

2.1培养基碳氮源选择

2.1.1 3-羟基丁酮

图1　　碳氮源筛选

2.1.2蛋白酶活性

蛋白酶活性检测的吸光值见图2，编号1—5分别表示浓度2 g/L、4 g/L、10 g/L、20 g/L、100 g/L。

由图2可知，最佳碳氮源分别是葡萄糖和玉米粉。

2.2单因素实验

2.2.1培养基成分

由于不同单因素条件发酵液中产生3-羟基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羟基丁酮含量较多，尤其是碳氮源单因素实验，必须进行适当稀释再测其含量。而蛋白酶含量相对较少，也可进行适当稀释较少倍数再进行测量。

2.2.1.1蛋白酶活性

（四）结构扁平，领导管理要求高。省军区系统重组重塑后，体制结构更加扁平，人员编成更加精干，对领导管理工作提出新的更高要求。由于省军区单位点多线长面广，且驻地相对分散，管理对象既有军官、士兵、文职人员和职工，还有专武干部和离退休干部，人员多样、成分复杂，领导管理任务重、压力大。因此，过去那种事无巨细“一竿子插到底”、大包大揽“保姆式”的领导管理方式显然已不适用，必须打破传统思维，跳出固有模式，创新理念方法，建立更加科学高效的领导管理和工作指导体系。

2.2.1.2 3-羟基丁酮

由表3—表6可知，最佳培养基成分单因素条件是葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、镁离子0.15 g/L、锰离子0.05 g/L、锌离子0.1 g/L、铁离子0.05 g/L。

2.2.2培养条件

由于不同单因素条件发酵液中产生3-羟基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羟基丁酮含量较多，必须进行适当稀释再测其含量。而蛋白酶含量相对较少，也可进行适当稀释较少倍数再进行测量。

图2　　碳氮源筛选

2.2.2.1蛋白酶

2.2.2.2 3-羟基丁酮

由表8可知，最佳培养基条件单因素条件为装液量80 mL/250 mL，转速175 r/min，培养时间40 h，接种量8%。

2.3实验优化设计

由表7可知，蛋白酶活性与3-羟基丁酮的产生量随各因素的变化趋势基本一致，无论是培养基成分还是培养条件都一致，故优化实验只针对单一因素3-羟基丁酮进行。

2.3.1 Plackett-Burman实验设计

对培养基成分和培养条件进行综合实验，随机编号为A玉米粉、B培养时间、C锰离子、D镁离子、E锌离子、F转速、G装液量、H葡萄糖、J铁离子、K接种量，结果见表9。

通过分析结果可见，葡萄糖（H）＞转速（F）＞时间（B）＞装液量（G）为最显著的4个因子，其中葡萄糖、时间为正效应，转速和装液量为负效应，因此确定对此4个因子做进一步实验——最陡爬坡实验。

2.3.2最陡爬坡实验

由表10可知，吸光值随各因子变化而变化的情况。当葡萄糖、转速、时间和装液量分别为80 g/L、165 r/min、45 h和70 mL/250 mL时，吸光值最大，因此，选此处作为中心点，进行下一步实验——Box-behnken实验设计。

2.3.3 Box-behnken实验设计

重新编码，A为葡萄糖，B为转速，C为时间，D为装液量，结果见表11。

如表11所示，A、AC、BD、A2显著，C2极显著，模型显著，失拟项不显著，说明该模型适合对该实验进行分析。

根据以上对实验数据的分析整合，对吸光值进行预测。当葡萄糖含量为70 g/L、转速为165 r/min、时间为40 h、装液量为70 mL时，吸光值预测值为0.3798。在此条件下进行实验，得到吸光值为0.3832，与预测值接近。

表3　培养基成分

表4　培养基成分

表5　培养基成分

表6　培养基成分

表7　培养条件

表9　结果分析

2.4产吡嗪的测定

分别应用优化前的工艺和最佳工艺进行16组发酵实验，进行对比，测得的6种吡嗪类产量总和见图4。

表1　0最陡爬坡实验结果

3　结论

通过实验优化设计，葡萄糖含量为70 g/L、转速为165 r/min、时间为40 h、装液量70 mL为最优发酵工艺。在此最优工艺下，吡嗪类产量比没有优化的工艺提高23.5%。

图3　因素间关系

表1　1 Box-behnken实验设计结果

图4　吡嗪类检测结果

参考文献：

［1］Ho J W，Jie M. Pharmacological activity of cardiovascular agents from herbal medicine［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2007，5：273-277.

［2］Masuda H，Mihara S. Olfactive properties of alkylpyrazines and 3-substituted 2-alkylpyrazines［J］. JAgric Food Chem，1988，36：584-587.

［3］Gabelman A. Bioprocess production of flavor，fragrance，and color ingredients［M］. New York：Wiley-Interscience，1994.

［4］汪江波，万朕，李莉，等.稻花香窖泥微生物群落变化研究［J］.酿酒科技，2010（6）：36-39.

［5］张温清，王永军.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪类健康功能因子的分析研究［J］.酿酒科技，2014（8）：37-42.

［6］庄名扬，王仲文，孙达孟，等.美拉德反应与酱香型白酒［J］.酿酒科技，1997（1）：73-77.

［7］王庆国，刘天明，韩小龙，等.两株产果香菌株的初步鉴定及香味成分分析［J］.食品研究与开发，2007，28（6）：16-19.

［8］成堃，路福平，李玉，等.产碱性蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及其酶学性质的初步研究［J］.中国酿造，2009（2）：33-36.

中图分类号：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0030-05

基金项目：窖泥中的微生物时空分布及代谢特性对其生命周期影响的研究（国家自然科学基金，项目号：31401680）；中国白酒3C计划。

收稿日期：2015-11-03

作者简介：武顺（1987-），硕士研究生。

通讯作者：王德良，男，博士，教授级高级工程师，中国食品发酵工业研究院酿酒工程部主任。

Optimization of Pyrazine-Producing Conditions of Bacteria by Response Surface Method

WU Shun，YAN Yinzhuo，HAN Xinglin and WANG Deliang
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：In this study，pyrazine-producing conditions of bacteria were studied. The bacteria were screened from different Daqu，and the influence of different factors on pyrazine yield by bacteria was investigated. The four main influencing factors including glucose，rotating speed，rotating time and fluid volume were optimized by single factor and response surface experiments. The results showed that the influencing factors ranked in decreasing sequence as glucose＞rotating speed＞rotating time＞fluid volume. The optimum technical parameters were summed up as follows：70 g/L glucose，rotating speed at 165 r/min，rotating time of 40 h，fluid volume of 70 mL. Under above conditions，pyrazine yield increased by 23.5%. Besides，the bacteria strain used in this study was with high yield of both protease and 3-hydroxy-2-butanone，and was superior to bacteria strains with high yield of single metabolite.

Key words：pyrazine；response surface method；technical optimization；Baijiu