Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达及意义

张　宏，王　文，田　甜，赵茜茜，马兴聪，闫婉君，高晓燕，张淑群

(西安交通大学第二附属医院肿瘤科，陕西西安　710004)



◇临床研究◇

Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达及意义

张宏，王文，田甜，赵茜茜，马兴聪，闫婉君，高晓燕，张淑群

(西安交通大学第二附属医院肿瘤科，陕西西安710004)

摘要：目的研究Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达及意义。方法应用免疫组化SP法测定24例三阴性乳腺癌、58例非三阴性乳腺癌及20例乳腺良性疾病组织中Ezrin的表达，比较各组Ezrin阳性表达率的差异，分析其与三阴性乳腺癌临床病理特征之间的关系。结果Ezrin在三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌及乳腺良性疾病组织中的阳性表达率分别为75.00%、48.28%、15.00%，三者比较差异有统计学意义(P<0.01)。三阴性乳腺癌中Ezrin高表达与组织学分级和临床TNM分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、肿瘤大小及腋窝淋巴结转移状况无关(P>0.05)。结论Ezrin在三阴性乳腺癌中高表达，提示其可以作为三阴性乳腺癌预后不良的一个重要指标。

关键词：Ezrin；三阴性乳腺癌；免疫组化

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的15%～20%，具有发病年龄早、侵袭性强、无病生存率低、病理恶性程度高、早期容易出现复发及转移、内分泌治疗及Her-2分子靶向治疗无效等特点，严重威胁患者的身心健康，现已成为乳腺癌研究领域的热点[1-2]。Ezrin是ERM(ezrin-radixin-moesin)蛋白家族成员之一，是一种细胞骨架和细胞膜的连接蛋白，几乎存在于任何细胞之中。近年研究发现，Ezrin高表达与乳腺癌等多种恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关。Ezrin可通过参与肿瘤细胞内信号转导、改变肿瘤细胞的极性及细胞迁移、调节肿瘤细胞间粘附及细胞与细胞外基质粘附等多种途径促进肿瘤细胞的侵袭和转移，是抗肿瘤药物作用的重要潜在靶点[3-5]。Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达及意义尚未见报道。本实验通过测定三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌及乳腺良性疾病组织中Ezrin的阳性表达率，比较Ezrin在各组之间表达情况的差异，并分析其与三阴性乳腺癌临床病理特征之间的关系，以期探讨三阴性乳腺癌复发转移率高、预后差的分子基础，从而为三阴性乳腺癌的靶向治疗提供新的靶点。

1材料与方法

1.1试剂及标本来源小鼠抗人Ezrin单克隆抗体(Thermo Fisher公司)；SP免疫组化染色试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。收集2014年3月至2015年3月西安交通大学第二附属医院肿瘤科收治的82例乳腺癌患者，均为浸润性导管癌。用免疫组化检测ER、PR及Her-2的表达情况，只有ER、PR及Her-2均不表达时定义为三阴性乳腺癌，有任何一个或几个表达则定义为非三阴性乳腺癌。82例中三阴性乳腺癌患者24例，非三阴性乳腺癌患者58例。三阴性乳腺癌患者年龄30～56岁，平均为(43.94±1.67)岁，临床分期包括：Ⅰ期6例、Ⅱ期6例、Ⅲ期12例。58名非三阴性乳腺癌患者年龄38～77岁，平均(50.78±2.01)岁，临床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期29例、Ⅲ期17例。另有乳腺良性疾病患者20例，包括9例乳腺囊性增生及11例乳腺纤维腺瘤。所有患者均为女性，全部经过病理学确诊且术前均未行放化疗。

1.2免疫组织化学SP法检测Ezrin表达标本经400 mL/L甲醛(100 mL/L福尔马林)固定，常规制作5 μm 厚连续切片。1张切片HE染色并进行复诊。

另采用免疫组织化学SP法检测Ezrin表达。石蜡切片经二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水后，置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，热平台修复抗原15 min，冷却至室温。30 mL/L H2O2室温孵育20 min后，PBS洗5 min×3次。正常山羊血清封闭20 min后，倾去不洗，滴加一抗(小鼠抗人Ezrin单克隆抗体，稀释比1∶100)，4 ℃放置过夜。PBS洗5 min×3次后，滴加二抗，室温放置20 min；磷酸盐缓冲液洗5 min×3次后，滴加SP，37 ℃孵育10 min。DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3评定标准Ezrin的阳性染色主要存在于细胞质内，为棕黄色颗粒。采用双盲法，在镜下随意选取5个视野，按染色深浅程度及阳性细胞百分比，并参考李琼等[6]的分级标准将Ezrin的表达情况分为3个等级：(-)，无表达；(+)，阳性细胞百分比<50%或染色程度较浅；()，阳性细胞百分比≥50%或染色程度较深。(-)及(+)判为Ezrin表达阴性，而()判为Ezrin表达阳性。

1.4三阴性乳腺癌中Ezrin阳性表达与患者临床病理特征的关系将三阴性乳腺癌患者分别按年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移状况、组织学分级、临床TNM分期进行分组，比较各组间Ezrin表达情况的差异。

1.5统计学分析采用SPSS 20.0统计软件行统计学分析，各组实验结果的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1乳腺组织中Ezrin的表达结果Ezrin阳性染色即镜下观察到的棕黄色颗粒，多数弥漫性表达在细胞质中，少部分表达在细胞膜上，而细胞核膜上均未见到阳性染色物(图1)。

图1Ezrin在不同乳腺组织中的表达

Fig.1 The expression of Ezrin in different breast tissues (×400)

A：三阴性乳腺癌组织；B：非三阴性乳腺癌组织；C：乳腺良性疾病组织。

Ezrin在乳腺良性疾病组织中的阳性表达率为15.00%(3/20)，在非三阴性乳腺癌组织中为48.28%(28/58)，在三阴性乳腺癌组织中为75.00%(18/24)。三组的结果差异具有统计学意义(χ2=15.736，P<0.001)。三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌中Ezrin的表达高于乳腺良性疾病，差异均有统计学意义(χ2=6.876，P=0.009；χ2=15.742，P<0.001)；三阴性乳腺癌组的Ezrin阳性表达率高于非三阴性乳腺癌组，差异具有统计学意义(χ2=4.923，P=0.027，表1)。

表1乳腺良性疾病组织、非三阴性乳腺癌组织和三阴性乳腺癌组织中Ezrin的表达情况

Tab.1The expression of Ezrin in breast benign disease tissue, non-triple negative breast cancer tissue and triple negative breast cancer tissue

组别例数Ezrin阴性阳性阳性率(%)乳腺良性疾病2017315.00非三阴性乳腺癌58302849.28*三阴性乳腺癌2461875.00*#

与乳腺良性疾病组比较，*P<0.05；与非三阴性乳腺癌组比较，

#P<0.05。

2.2三阴性乳腺癌中Ezrin阳性表达与患者临床病理特征的关系三阴性乳腺癌患者年龄≤50岁组的Ezrin阳性表达率为72.73%(8/11)，>50岁组为76.92%(10/13)，差异无统计学意义(P=1.000)；原发肿瘤最大直径≤2cm组和>2cm组的Ezrin阳性表达率分别为66.67%(6/9)、80.00%(12/15)，差异无统计学意义(P=0.635)；腋窝淋巴结转移阳性组Ezrin阳性表达率为87.50%(7/8)，较阴性组的68.75%(11/16)增高，但差异无统计学意义(P=0.621)，这可能与样本数量较小有关；Ezrin阳性表达率随着组织学分级的增加而逐渐升高，组织学分级G1级组的Ezrin阳性表达率为33.33%(2/6)，G2级组为75.00%(3/4)，G3级组为92.86%(13/14)，差异有统计学意义(P=0.016)；临床TNM分期Ⅰ～Ⅱ期组的Ezrin阳性表达率为50.00%(6/12)，Ⅲ期组为100.00%(12/12)，差异具有统计学意义(P=0.014，表2)。

3讨论

三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种特殊类型，与非三阴性乳腺癌相比，有其特有的生物学特征，预后差，多发于绝经前女性，多数有乳腺癌家族史，异质性和组织学分级较高，部分与遗传基因BRCA1相关，多数具有基底细胞样表型的特点。病理类型以浸润性导管癌为主，较早发生局部复发和远处转移，容易发生内脏转移，表达P-cadherin、EGFR、CK 5/6、P53较多而表达AR、E-cadherin、Cyclin D较少，5年生存率和总生存率均低于非三阴性乳腺癌[7-8]。因此，三阴性乳腺癌已经成为目前乳腺癌治疗领域亟待解决的难题。

表2Ezrin表达与三阴性乳腺癌患者临床病理特征的关系

Tab.2The expression of Ezrin and its relationship with clinicopathologic features of patients with triple negative breast cancer

临床病理特征例数Ezrin表达(例数)阴性阳性阳性率(%)P值年龄(岁)1.000 ≤50113872.73 >501331076.92肿瘤大小(cm)0.635 ≤293666.67 >21531280.00淋巴结转移0.621 阴性1651168.75 阳性81787.50组织学分级0.016 高分化(G1)64233.33 中分化(G2)41375.00 低分化(G3)1411392.86临床TNM分期0.014 Ⅰ～Ⅱ期126650.00 Ⅲ期12012100.00

Ezrin蛋白的分子质量约为82 ku，由定位于人染色体6q25.2-q26的Villin2基因编码，其结构主要包括3个部分：N-端是具有高度同源性的FERM功能域，可与多种细胞表面粘附分子(CD44、c-Met、ICAM1、ICAM2等)相结合，调节细胞与细胞或细胞与细胞外基质之间的粘附，从而影响肿瘤细胞的侵袭和转移；中间是连接N-端和C-端的α螺旋结构；C-端是可与细胞骨架肌动蛋白相连的F-肌动蛋白结合区，该区内含有Ezrin的磷酸化活化位点。方军[9]研究发现，乳腺癌组织中Ezrin的表达显著高于乳腺良性疾病组织，其表达与淋巴结转移、临床分期有关，而与患者年龄、肿瘤大小等无关。王明喜等[10]的研究也证实，乳腺癌中Ezrin表达上调，其高表达在乳腺癌的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用。MAK等[11]研究发现Src通过调节Ezrin蛋白第477位上的酪氨酸残基的磷酸化调控乳腺癌细胞的侵袭和转移。ELLIOTT等[12]用鼠乳腺癌细胞系AC2M2进行移植实验，发现将表达野生型Ezrin的细胞移植到同基因型小鼠的乳房脂肪垫中可引起肺转移，而Ezrin活性被抑制的细胞移植后则没有观察到肺转移，说明Ezrin在乳腺癌的侵袭、转移中是必不可少的。LI等[13]发现使用RNA干扰技术使Ezrin基因表达沉默后可有效降低乳腺癌细胞的侵袭转移能力，证实Ezrin参与了乳腺癌的侵袭和转移过程。

本研究结果显示，Ezrin在三阴性乳腺癌组织与非三阴性乳腺癌组织中的表达差异具有统计学意义，Ezrin在三阴性乳腺癌组织中高表达提示Ezrin可作为三阴性乳腺癌预后不良的指标之一。Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达与组织学分级以及临床TNM分期有关。马力[14]的研究表明，在乳腺浸润性导管癌中Ezrin的表达水平随着组织学分级、临床TNM分期的增加而逐渐升高，其表达与组织学分级和临床TNM分期呈正相关。但是本研究中Ezrin的表达与腋窝淋巴结转移状况无关，可能是由于样本量较少的缘故。Ezrin在三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌中的表达均显著高于乳腺良性疾病，这与GSCHWANTLER-KAULICH等[15]的研究结果一致。

Ezrin在三阴性乳腺癌中高表达可能是三阴性乳腺癌侵袭性强、早期容易出现复发及转移的原因之一，但是其在三阴性乳腺癌侵袭、转移过程中的具体作用及详细机制尚不清楚，其表达上调的机制也有待进一步研究。检测Ezrin在三阴性乳腺癌患者中的表达情况可能有助于判断其预后，并为其早期诊断及靶向治疗提供一定的依据。相信随着大量相关实验的开展与研究，Ezrin有望为三阴性乳腺癌的诊治提供新的靶点。

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(编辑国荣)

收稿日期：2015-12-31修回日期：2016-03-11

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81274136)

通讯作者：张淑群. E-mail: zhangshuqun1971@aliyun.com

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604021

The expression and significance of Ezrin in human triple negative breast cancer

ZHANG Hong, WANG Wen, TIAN Tian, ZHAO Xi-xi, MA Xing-cong,YAN Wan-jun, GAO Xiao-yan, ZHANG Shu-qun

(Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression and significance of Ezrin in triple negative breast cancer tissues. MethodsWe selected 102 cases, including 24 ones of triple negative breast cancer, 58 ones of non-triple negative breast cancer, and 20 of benign breast disease. The expression of Ezrin in all the specimens was detected by SP immunohistochemistry. We observed whether there was any difference between the positive expression rates of Ezrin in the three groups. We also analyzed the correlation between Ezrin expression and clinicopathologic parameters of triple negative breast cancer. ResultsThe positive expression rate of Ezrin in groups of triple negative breast cancer, non-triple negative breast cancer, and benign breast disease was 15.00%, 48.28% and 75.00%, respectively. The difference between the three groups differed significantly (P<0.01). The high expression of Ezrin in triple negative breast cancer had relationship with histological grading and clinical TNM staging (P<0.05), but not with patients’ age, tumor size, or axillary lymph node metastasis (P>0.05). ConclusionEzrin is highly expressed in triple negative breast cancer tissues; therefore, it can be used as an important indicator of poor prognosis of triple negative breast cancer.

KEY WORDS:Ezrin; triple negative breast cancer; immunohistochemistry

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81274136)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.1736.018.html(2016-06-08)