慢病毒转染荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L细胞模型的构建

肖　远，许　荣，李秀敏，刘　艳，黎　星，霍　聪，王晓明

(第四军医大学第一附属医院老年病科，陕西西安　710032)



◇基础研究◇

慢病毒转染荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L细胞模型的构建

肖远，许荣，李秀敏，刘艳，黎星，霍聪，王晓明

(第四军医大学第一附属医院老年病科，陕西西安710032)

摘要：目的构建稳定表达EYFP荧光蛋白的HeLa细胞作为阴离子(卤素)通道阻断剂筛选的细胞模型，为高通量筛选阴离子(卤素)通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞产生慢病毒颗粒，感染HeLa细胞，进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选，纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP-H148Q/I152L的表达效率。并验证EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT-PCR和Western blot检测结果显示，目的基因在HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到EYFP-HeLa稳转细胞株能够表达特有的EYFP黄色荧光，效率接近100%。碘离子(I-)(低渗)溶液刺激细胞阴离子(卤素)通道的开放，内流的I-能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP-HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白，对内流入细胞的I-敏感，可以作为理想的阴离子(卤素)通道阻断剂的筛选模型。

关键词：阴离子；卤素；荧光蛋白；阴离子通道阻断剂；筛选模型；基因重组

氯、碘、溴等阴离子(卤素)是维持人体细胞内环境及发挥正常功能的重要成分，细胞质膜对水及各种离子的动态平衡，依赖于细胞膜上各种通道蛋白及转换器的作用。特别是在各种病理性损伤过程中，如发生细胞肿胀等内外液渗透压的改变时，需通过水及各种离子的转运机制进行调节[1]，例如，在肠道分泌、神经元电位、维持细胞容积等内环境的稳态中起至关重要的作用[2]。很多疾病的发生都与其调节过程出现问题密切相关。大量研究发现，离子通道阻断剂具有重要的干预作用，特别是阴离子通道阻断剂DIDS等可以有效抑制缺血再灌注心肌细胞的损伤[3-4]。而寻找一种具有高效的天然化合物筛查技术尤为迫切而重要。黄色荧光蛋白YFP的突变体因其具有能被碘离子(I-)淬灭的特性，被广泛用作监测信号，反映细胞的生理活动[5]，使得动态、精确地监测阴离子(卤素)生理活动成为可能，对于监测细胞生理反应有重要意义。本研究旨在应用基因重组技术构建搭载YFP突变蛋白(EYFP-H148Q/I152L)基因的慢病毒载体，转染HeLa细胞，拟建立稳定的细胞模型作为阴离子(卤素)通道阻断剂的筛查模型，为高通量筛选候选化合物提供实验模型。

1材料与方法

1.1材料EYFP-H148Q/I152L-GFP质粒为吉林大学所赠，慢病毒载体为GV341、pHelper 1.0和pHelper2.0质粒组成，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，大肠杆菌DH5α、293T细胞系及HeLa细胞系均为本实验室保存。限制性内切酶AgeⅠ、NheⅠ购自NEB公司，DNA Marker、Taq酶购自Fermatas公司，胶回收试剂盒购自北京天根公司，质粒提取试剂盒购自Promega公司，引物合成及DNA测序均由捷瑞生物完成，荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司，FLAG抗体购自Sigma公司。胎牛血清(FBS)、DMEM、胰酶均购自GIBCO公司，DMSO购自Sigma公司。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、Trizol购自Invitrogen公司，其他化学试剂为国产分析纯。

1.2目的片段的扩增以吉林大学所赠EYFP-H148Q/I152L-GFP质粒为模板扩增。上游引物：CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGC-

TGAGCAAGGGCGAGGAG，下游引物：AATGCA-

ACTCTGAGCTAGCTCTTGTACAGCTCGTCCA-

TG(斜体部分为酶切位点)，扩增目的片段为762 bp。10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并按照胶回收试剂盒说明书回收目的片段。

1.3重组慢病毒载体的构建与鉴定将慢病毒载体GV341和回收的目的基因片段分别用限制性内切酶AgeⅠ和NheⅠ进行双酶切后，电泳回收酶切产物，之后使两种酶切产物在连接酶的作用下，16 ℃连接过夜。将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆的一半菌落进行PCR鉴定后送检测序。检测时的上游引物：GGGTCAATAATTTTCAGTG，下游引物：CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，阳性目的片段为930 bp。测序正确后扩增选定菌落并大量提取质粒保存备用。

1.4病毒包装与滴度测定转染前24 h将293T细胞用胰酶消化后重新接种于15 cm细胞培养皿中，细胞密度为9×107细胞/皿。于37 ℃、50 mL/L CO2条件下培养约24 h至细胞融合达70%～80%时转染。转染前2 h更换为无血清培养基，用Opti-MEM稀释待转混合质粒(20 μg pGV341-YFP、15 μg pHelper 1.0和10 μg pHelper 2.0)，使总体积为2.5 mL，室温下温育5 min。同时在另一管中将100 μL Lipofectamine 2000用2.4 mL Opti-MEM稀释并置室温温育5 min。将上述2管溶液混合后，室温温育20 min后加入293T细胞中，混匀，置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养。转染8 h后换为新鲜培养液继续培养。48 h后，荧光显微镜下可见荧光蛋白表达，用0.45 μm滤器过滤收集上清液，即为病毒液。

将该病毒液进行10倍连续梯度稀释后，感染293T细胞，感染后48 h加入5 μg/mL puromycin，继续培养2 d 后，荧光显微镜观察计数EYFP阳性细胞，确定病毒滴度(即带有荧光的细胞数与病毒原液量之比)。

1.5病毒载体感染和稳转细胞系的构建

1.5.1病毒感染生长状态良好处于对数生长期的目的细胞，感染前1 d将目的细胞(细胞数约为5×104)分入6孔板，37 ℃、50 mL/L CO2培养箱培养，待细胞融合度达到约30%，根据细胞感染复数值(multiplicity of infection, MOI)，加入适宜量的病毒感染。12 h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基，当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 d后，荧光显微镜下观察EYFP表达情况，荧光率达80%以上用于筛选构建稳转细胞系。感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验。

1.5.2稳转细胞系的构建将待筛选细胞接种于6孔板中至融合度约80%，加入puromycin进行空细胞致死最低浓度筛选，置0、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL进行筛选，获取药物处理48 h细胞全部死亡的最低药物浓度。

将细胞接种在6孔板中，贴壁后进行慢病毒感染，感染第4天，加入puromycin药物筛选。对筛选后的细胞即时观察荧光效率，判断是否获得感染效率接近100%的细胞。将细胞消化后，接种于96孔板中，保证1个/孔，接种后第2天观察孔板，标记出具有单个细胞的孔，同时加入puromycin药物。继续培养标记孔的细胞4～5 d，待孔板中细胞长至细胞克隆时，挑取多组单个细胞克隆孔板中的细胞进行扩大培养，至48孔板，再逐级放大，中间取12孔板80%融合度的细胞，用Trizol提取总RNA，6孔板的细胞提取蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot检测，选择检测合格的单克隆细胞扩增培养至需要的细胞量后冻存。

1.5.3稳转细胞系的RT-PCR检测将提取到的总RNA利用反转录试剂盒反转录得到cDNA，进行定量PCR检测，以GAPDH为内参。根据Promega公司的M-MLV试剂盒说明书进行操作，首先将1 μL OligodT和2.0 μg总RNA加入无RNA酶H2O中，补H2O至总体积为10 μL，70 ℃处理后置冰浴中使模板和OligodT退火，随后在该管中继续加入5×RT buffer 4 μL、10 mol/L dNTPs 2 μL、RNA酶抑制剂16 Units、RNA酶200 Units，补水至20 μL，反转录得到cDNA。定量PCR反应体系为20 μL，SYBRpremixexTaq10 μL，引物、cDNA各1 μL，补水至20 μL，按照两步法进行定量PCR，程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共45个循环。通过2-ΔΔCt法计算稳转细胞株与阴性对照细胞中YFP的相对表达量，定量PCR所需引物见表1。

表1实时定量PCR所需引物

Tab.1Primers needed for RT-PCR

基因引物序列GAPDHF:TGACTTCAACAGCGACACCCAR:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAAYFPF:CCGACAAGCAGAAGAACGGR:GAACTCCAGCAGGACCATG

1.5.4稳转细胞系的Western blot检测将6孔板中收集到的稳转HeLa细胞经裂解收取蛋白，以GAPDH为内参，重组慢病毒载体中的FLAG为待检标签蛋白，分子质量为29 ku，以48 ku的SURVIVIN-3FLAG-GFP为阳性对照，进行120 g/L聚丙烯酰氨凝胶电泳，蛋白上样量20 μL，半干转印法将蛋白转到PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，TBST洗膜3次，每次5 min后再加入鼠源FLAG抗体(1∶2 000)4 ℃过夜，TBST洗膜3次后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，洗膜后用ECL发光液显色，X-胶片曝光显影定影。以预染的蛋白Marker确定蛋白相对分子质量。

1.6EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性验证EYFP-HeLa稳转细胞系分2组，以等渗NaCl为对照，低渗NaI刺激阴离子(卤素)，并对荧光强度进行动态检测。

2结果

2.1慢病毒表达载体的构建与鉴定利用PCR方法从吉林大学所赠质粒模板中扩增得到约750 bp的特异性条带(目的基因)，与762 bp的目的基因相符(图1A)。挑取8个重组慢病毒表达载体单克隆进行菌液PCR鉴定，各菌落均检测到930 bp的特异性条带(图1B)，与预期相符。并将3号菌液送检测序。

图1目的基因YFP的获取及慢病毒载体的PCR鉴定

Fig.1 Cloning of YFP CDS sequence and identification oflentiviral vector GV341

A：质粒PCR结果。M：Marker；S：PCR扩增得到YFP基因条带。B：PCR结果示重组慢病毒菌液YFP突变基因的表达。N：阴性对照ddH2O；N1：空载连续对照；P：阳性对照GAPDH；M：Marker；1～8：含YFP基因菌液1～8组。

2.2病毒滴度测定倍比稀释后的病毒加puromycin继续感染细胞2 d后，在荧光倒置显微镜下观察EYFP阳性细胞的数量，计算所得病毒载体的病毒滴度为2E+8 TU/mL。

2.3稳转HeLa细胞株的建立及RT-PCR和Western blot检测结果

2.3.1稳转HeLa细胞系中EYFP荧光效率稳转HeLa细胞系中EYFP荧光阳性率接近100%(图2)。

2.3.2稳转HeLa细胞系的RT-PCR和Western blot检测结果2-ΔΔCt法计算得出稳转HeLa细胞组较未转染阴性对照组中YFP mRNA表达水平提高了4 363.599倍；Western blot结果显示，6孔板中的稳转HeLa细胞蛋白样品可检测到标志重组慢病毒载体的大小为29 ku的目的条带(图3)。

图2稳转EYFP-HeLa细胞的荧光鉴定

Fig.2 The fluorescence detection of transfected EYFP-HeLa cell line (×200)

A：明场；B：荧光激发；C：A、B重合。

图3EYFP基因的表达(A)及EYFP荧光蛋白(B)的鉴定结果

Fig.3 YFP expression of YFP-HeLa cell line detected by RT-PCR (A) and Western blot (B)

CON：对照组；SAMP：感染慢病毒载体的HeLa细胞。与CON组比较，*P<0.01；GAPDH：内参；P：阳性对照 SURVIVIN-3FLAG-GFP，48 ku；1～7：7组YFP-HeLa细胞，在1～3、5、6、7组检测到标志重组慢病毒载体，大小为29 ku。

2.4EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性验证EYFP-HeLa稳转细胞系低渗NaI刺激阴离子(卤素)通道开放，荧光淬灭，低渗NaI较等渗NaCl荧光读值随时间明显下降(P<0.05。图4)。

3讨论

阴离子通道广泛存在于哺乳动物的细胞膜上，其在维持组织细胞的内环境稳定，调节细胞的容积、细胞膜电位、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡中起着重要作用[6-9]。

课题组前期在staurosporine、缺血再灌注及衣霉素分别通过线粒体、受体及内质网应激等途径构建的心肌细胞凋亡模型上，发现Cl-通道参与了细胞的凋亡过程，应用特异性阻断剂DCPIB和非特异性阻断剂DIDS能有效抑制细胞凋亡性死亡，特别是在体心脏中能够减少梗死面积、改善心脏功能、抑制心律失常的发生，达到保护受损心脏的作用[10-15]。MIZOGUCHI等[16]也在大鼠心脏进行异体异位移植过程中证实了上述的心脏保护作用。上述证据证明，心肌细胞膜上阴离子通道对维护细胞膜稳定、减少细胞损伤具有重要的保护作用。

氯离子作为细胞内最主要的阴离子，其相关的通道阻断剂也仅仅是作为工具药应用于实验室，能否在众多化合物中寻找出具有氯离子阻断作用的成分？如何实现在大量化合物中筛查出具有目的功能的化合物呢？本研究的主要目的是构建稳定成熟的离子通道阻断剂的方法。

我国具有丰富的中草药资源，随着现代中药研究的进展，许多重要天然中药单体化合物从分子结构、药理学及毒理学被清楚地阐明[17]。同时，已有多种单体化合物从传统天然化合物中提取得到，并证实作为通道阻断剂发挥着抗凋亡、抗缺血再灌注等心肌保护作用[18-20]。然而，目前常用于离子通道药物筛选的方法如膜片钳技术，由于操作较难，成本高、耗时、耗工，仅适用于少量化合物特异活性功能的证实，对于化合物的大批量初次筛选无法实现[21]。而高通量筛选技术的出现解决了这一难题，且我国丰富的传统天然化合物库也满足该技术对样本量的要求。在此基础上，如何构建一种用于高通量筛选的低成本、操作便捷、信号检测快速灵敏的实验模型对于大批量化合物的筛选至关重要。

图4 EYFP-HeLa细胞系对I-低渗的活性功能验证Fig.4VerificationofactivityofEYFP-HeLacelllineonI-(lowpermeability)solutionA:NaIHypo刺激离子通道开放,I-内流荧光淬灭程度与NaCliso组比较的荧光强度结果;B:动态数据分析,两组之间比较,P<0.05。

2012年，STOTZ等[22]报道荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L可用于阴离子通道的研究，发现该突变的黄色荧光蛋白能够在卤素离子的刺激下发生淬灭反应，从而反映离子通道的开闭情况。该研究技术也在多个阴离子(卤素离子)通道的研究中广泛应用[2,5,23-24]，为我们利用基因重组技术构建EYFP-H148Q/I152L-HeLa细胞模型提供了重要的依据及方法。本研究通过基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体，应用RT-PCR和Western blot检测目的基因在HeLa细胞中表达良好，荧光显微镜下稳转细胞株EYFP黄色荧光效率接近100%，而I-低渗溶液刺激细胞阴离子通道开放后，内流的I-能够使黄色荧光淬灭。结果显示，构建的荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L-HeLa细胞模型，通过检测该细胞在低渗I-溶液刺激下发生荧光淬灭的特性，可用于大规模筛选抑制荧光淬灭的阴离子通道阻断剂。

该模型构建方便，相关技术成熟；成本较低；检测信号灵敏、动态、可视。通过检测荧光信号使得便捷快速筛选天然化合物成为可能，对初筛结果的稳定性、可靠性具有重要意义，从模型上保证了初筛结果的可信。

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(编辑国荣)

收稿日期：2015-11-27修回日期：2016-02-19

基金项目：军队保健计划课题(No.13BJZ34)及卫生部行业基金(No.201302008)资助

通讯作者：王晓明. E-mail: xmwang@fmmu.edu.cn

中图分类号：R965.1

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604003

The cell model establishment through lentivirus transfecting fluorescent protein EYFP-H148Q/I152L

XIAO Yuan, XU Rong, LI Xiu-min, LIU Yan, LI Xing, HUO Cong, WANG Xiao-ming

(Department of Geriatrics, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish the HeLa cell line that can stably express EYFP fluorescent protein as the model for anion channel blocker (halide ion) screening, which lays the foundation for high throughput screening of anion channel blocker (halide ion). MethodsThrough gene recombination technology, a new lentivirus vector which can express mutant protein YFP (EYFP-H148Q/I152L) and puromycin resistance, was built. The mixture of lentivirus vector and packaging plasmid was transfected into 293T cells to produce lentivirus particles. After infection of HeLa cells by the lentivirus particles, puromycin was used to screen the cells as YFP-positive HeLa cell line. Then cell amplification was carried out after purification and efficiency of EYFP-H148Q/I152L was further detected by Real-time quantitative PCR (RT-PCR) and Western blot. We then verified the activity of EYFP-HeLa transfected cell line as a screening model of anion channel blocker. ResultsGene sequencing verified that EYFP-H148Q/I152L was successfully inserted into lentivirus vectors. RT-PCR and Western blot results showed that the target gene was overexpressed in HeLa cells. The specific yellow fluorescence of EYFP of HeLa cells could be observed under fluorescence microscope with the efficiency of nearly 100%. I- (low permeability) solution stimulated the opening of anion (halogen) channels, and the yellow fluorescence was quenched by I- flow into cells. ConclusionThe EYFP-HeLa cell line can stably express EYFP yellow fluorescent protein and is sensitive to the internal flow of I-. Therefore, it can be used as an ideal screening model of anion channel blocker (halide ion).

KEY WORDS:anion; halide ion; fluorescence protein; anion channel blocker; screening model; gene recombination

Supported by the Health Care Plan of the Army (No.13BJZ34) and the Industry Fund of Ministry of Health (No.201302008)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0911.006.html(2016-06-08)